重症肌无力患者他克莫司血药浓度监测与CYP3A5基因检测分析

陈頔 张华 殷剑 田晓鑫 侯世芳 赵明 杨莉萍

重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是由乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor，AChR)抗体介导，累及神经肌肉接头突触后膜的自身免疫性疾病。若病情控制不佳极易导致呼吸肌无力，出现肌无力危象，危及生命。他克莫司为一种强效免疫抑制剂，适用于不能耐受糖皮激素以及糖皮质激素依赖型MG患者。但由于他克莫司的治疗窗窄、个体差异大，需要根据血药浓度调整用药剂量，而患者的病理生理状态、遗传特征、合并用药等诸多因素均可影响其血药浓度与治疗效果。因此，探讨他克莫司的药物基因多态性以及药物相互作用具有重要意义，是当今研究的前沿和热点。目前关于MG患者他克莫司的个体化治疗研究相对较少。本研究通过对MG患者他克莫司血药浓度及药物基因检测进行分析，旨在为临床用药提供参考。

1 对象和方法

1.1 对象收集2015年1月至2018年12月在北京医院神经内科经他克莫司治疗的住院MG患者258例。纳入标准：(1)MG诊断明确[1]；(2)连续应用他克莫司 2周以上。排除标准：(1)严重肝、肾功能不全患者；(2)恶性肿瘤患者。本研究经北京医院伦理委员会批准，患者及家属均知情同意。

1.2 方法

1.2.1资料收集：收集患者性别、年龄、身高、体重等一般资料；他克莫司用药剂量、血药浓度结果；与他克莫司存在药物相互作用的药物使用情况，包括糖皮质激素、钙离子通道阻滞剂(calcium channel blocker，CCB)、他汀类药物(如阿托伐他汀及辛伐他汀)、质子泵抑制剂(proton pump inhibitor，PPI；如奥美拉唑及艾司奥美拉唑)以及其他可能明显影响他克莫司血药浓度的药物；CYP3A5 基因多态性检测结果。

1.2.2他克莫司血药浓度监测：他克莫司血药浓度达稳态后(维持剂量1周左右)，采血当天于服药前用EDTA抗凝管取静脉血2 mL测定他克莫司谷浓度。主要检测步骤：将血标本缓慢翻转混匀后，取200 μL全血置于离心管中，加入200 μL 他克莫司全血沉淀剂，快速混匀样本5～10 s，待充分混匀后以13 000 r/min离心4 min(离心半径50 mm)，取上清液置于他克莫司预处理管中，轻轻混匀5～10 s，上机检测。采用化学发光微粒子免疫分析法(雅培，Architect I1000)测定他克莫司的全血谷浓度。再根据血药浓度结果调整他克莫司用药剂量，使MG患者的稳态谷浓度维持在治疗窗范围内(5～10 ng/mL)。为便于比较，排除服药剂量对血药浓度的影响，将他克莫司血药浓度除以患者每天剂量，得到剂量标准化谷浓度(C/D)，单位ng/(mL·mg)。

1.2.3CYP3A5基因多态性检测：使用EDTA抗凝管取静脉血2 mL，缓慢翻转混匀后，按照以下步骤处理：将1000 μL NH4Cl加入1.5 mL离心管，加入200 μL全血，混匀后室温放置5 min，以3000 r/min离心5 min(离心半径50 mm)，弃上清。向离心管中加入150 μL耀金保试剂，用200 μL移液器反复吹打混匀，室温放置20～30 min，期间缓慢颠倒混匀2次。将经上述处理后的白细胞保存液1.0 μL，加入测序反应通用试剂盒(耀金分)中，上机检测。采用荧光染色原位杂交检测方法，使用配套的实时荧光定量PCR仪、微测序基因分析系统，检测CYP3A5*3 6986 A>G基因位点。

1.3 统计学处理应用SPSS19.0软件进行统计学分析，对数据进行正态性和方差齐性检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两均数间比较采用独立样本t检验，多组均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法检验；计数资料用卡方检验；C/D值与患者年龄、体重的相关性采用Pearson相关分析；采用多重线性回归方法逐步筛选影响血药浓度的因素。以P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者基本资料共纳入258例MG患者，其中男129例，女129例，年龄14～87岁，平均(56.3±16.7)岁，体重40～115 kg，平均(68.6±13.3)kg，身高150～195 cm，平均 (166.3±8.5)cm。他克莫司的用药量为0.5～5.5 mg/d，平均(2.73±0.97)mg/d。

2.2 他克莫司血药浓度分布情况258例MG患者共进行378例次他克莫司谷浓度测定，平均浓度为(6.02±4.93)ng/mL。根据他克莫司治疗MG的治疗窗(5～10 ng/mL)，将患者血药浓度分为低(<5 ng/mL)、正常(5～10 ng/mL)、高(>10 ng/mL)3组。血药浓度低、正常、高组检测例次分别为208例次(55.02%)、126例次(33.33%)和44例次(11.64%)，平均用药剂量分别为(2.54±1.00)、(2.91±0.83)、(2.79±0.98)mg/d，3组间平均用药剂量比较无统计学差异(P=0.158)，提示MG患者他克莫司的血药浓度不完全由用药剂量决定。

2.3 CYP3A5基因对血药浓度的影响共有227例患者进行CYP3A5基因检测，其中CYP3A5*1*1者27例(11.89%)、CYP3A5*1*3者94例(41.41%)、CYP3A5*3*3者106例(46.70%)。经Hardy-Weinberg检验分析，P>0.05，提示各基因频率达到遗传平衡，资料具有群体代表性。

2.3.1不同基因型患者C/D值比较：227例患者住院期间共进行275例次他克莫司血药浓度检测，其中CYP3A5*1*1、CYP3A5*1*3、CYP3A5*3*3患者分别检测41、118、116例次，C/D值分别为 (1.11±0.23)、(1.54±0.76)、(3.43±0.61)ng/(mL·mg)，3组间C/D值差异有统计学意义 (F=38.497，P<0.01)，两两比较结果显示，CYP3A5*1*1和CYP3A5*1*3患者C/D值低于CYP3A5*3*3患者(均P<0.05)，而CYP3A5*1*1和CYP3A5*1*3患者间比较无统计学差异(P>0.05)。

表1 不同基因型MG患者他克莫司达治疗窗时用药剂量及达治疗窗时不同用药量患者分布比较

注：MG：重症肌无力，表2同

2.3.2不同基因型患者血药浓度比较：我国指南中他克莫司的推荐剂量为3 mg/d，本研究对采用此剂量治疗的MG患者共78例次的他克莫司血药浓度进行分析，结果显示，其中CYP3A5*1*1型12例次，CYP3A5*1*3型39例次，CYP3A5*3*3型27例次，平均血药浓度分别为(2.73±1.09)、(4.35±2.67)、(8.25±6.02)ng/mL，3组间血药浓度比较差异有统计学意义(F=10.629，P<0.01)。两两比较结果显示，CYP3A5*1*1和CYP3A5*1*3患者血药浓度水平低于CYP3A5*3*3患者(均P<0.05)，而CYP3A5*1*1和CYP3A5*1*3患者间比较无统计学差异(P>0.05)。提示按照他克莫司3 mg/d剂量治疗，CYP3A5*1*1和CYP3A5*1*3型患者血药浓度低于治疗窗，CYP3A5*3*3型患者可达治疗窗。

2.3.3不同基因型患者用药剂量及达治疗窗分布：在275例次检测中，共91例次血药浓度达治疗窗。3种基因型患者他克莫司血药浓度达治疗窗时用药剂量比较差异有统计学意义(P<0.01)，两两比较结果显示，CYP3A5*1*1患者达治疗窗时用药剂量高于CYP3A5*1*3者(P<0.05)，CYP3A5*1*3者高于CYP3A5*3*3者(P<0.01)。根据我国指南中他克莫司推荐用药剂量3 mg/d作为分类标准，统计不同基因型患者达治疗窗时例次情况，结果显示，在血药浓度达标患者中，CYP3A5*1*1型患者达标的4例次中用药剂量全部>3 mg/d，CYP3A5*1*3型患者中18例次(52.9%)用药剂量>3 mg/d，而CYP3A5*3*3型患者中31例次(58.5%)用药剂量<3 mg/d。结果见表1。

2.4 人口学特征对血药浓度的影响男性与女性MG患者平均血他克莫司 C/D值比较差异无统计学意义〔(2.50±1.94)ng/(mL·mg)比(2.41±2.08)ng/(mL·mg)；t=1.667，P=0.097〕。Pearson相关性分析结果显示，C/D值与年龄(r=-0.054，P=0.297)和体重(r=-0.017，P=0.743)无相关性。

2.5 合并用药情况及其对血药浓度的影响在378例次的血药浓度监测中，其中187例次合并使用可能影响他克莫司血药浓度的药物，包括糖皮质激素、他汀类药物、CCB、PPI及其他影响他克莫司血药浓度的药物。仅联合使用1种可能影响他克莫司浓度药物的检测为135例次，其中联合使用糖皮质激素者63例次，联合使用他汀类药物者35例次，联合使用CCB者29例次，联合使用PPI者8例次，血他克莫司 C/D值分别为(1.91±1.58)、(1.75±0.72)、(2.31±1.32)、(2.49±1.63)ng/(mL·mg)，与未合并使用影响他克莫司用药患者〔191例次，(2.72±1.91)ng/(mL·mg)〕比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。

2.6 多因素线性回归分析他克莫司剂量、CYP3A5基因型、合并使用PPI(奥美拉唑或艾司奥美拉唑)与他克莫司血药浓度存在相关性(P<0.05)。结果见表2。

表2 影响MG患者他克莫司血药浓度的多因素线性回归分析结果

注：/：表示无数据；激素：糖皮质激素；他汀：他汀类药物；CCB：钙离子通道阻滞剂；PPI：质子泵抑制剂

3 讨论

他克莫司作为强效免疫抑制剂，于1997年开始应用于MG的动物模型研究[2]。此后，国内、外多位学者相继对他克莫司治疗MG开展了临床研究。一项系统评价共纳入了12个研究[3]，结果显示他克莫司可降低MG患者定量MG评分(quantitive MG score，QMG)，减少激素依赖性患者激素的用量，且安全性较好。由于他克莫司个体差异大，诸多因素影响他克莫司的血药浓度。首先，在遗传特征方面，CYP3A5*3为主要影响他克莫司血药浓度的基因，系统评价及Meta分析证实在肾移植或肝移植患者中，CYP3A5*3突变与他克莫司用药量之间存在基因-剂量关系[4-5]。其次，在人口学方面，研究表明，器官移植患者他克莫司的血药浓度与患者的年龄、性别、体重指数等人口生物学因素有关，但尚无确切定论。有文献报道与男性肾移植患者相比，女性肾移植患者他克莫司的药时曲线下面积、谷浓度及浓度/剂量比均较低[6-7]。第三，在药物相互作用方面，他克莫司由CYP3A4、3A5及P-糖蛋白介导，与多种药物存在药物相互作用。有研究[7-8]表明合用抗真菌药、PPI、CCB、大环内酯类抗菌药、糖皮质激素药物可使移植患者他克莫司的C/D值发生改变。然而，目前关于他克莫司的血药浓度影响因素的研究绝大多数以器官移植患者为研究对象，而MG患者的治疗方案与给药剂量与移植患者存在很大差异，而针对MG患者的相关研究十分匮乏。

本研究依据治疗窗将患者血药浓度分为低、正常、高3组，结果显示虽然血药浓度差异较大，但各组患者用药剂量无统计学差异，表明MG患者他克莫司的代谢个体差异较大；进一步分析影响他克莫司血药浓度的影响因素发现：首先，CYP3A5基因多态性检测的结果显示，CYP3A5*1*1组和CYP3A5*1*3的C/D值无统计学差异，而CYP3A5*1*1组和CYP3A5*1*3组的C/D值低于CYP3A5*3*3组，并且通过分析不同基因型血药浓度的达标情况和用药剂量显示，CYP3A5*1*1型患者他克莫司达标适宜剂量为4.0 mg/d、CYP3A5*1*3型约为3.47 mg/d、CYP3A5*3*3型约为2.54 mg/d，因此如果按照予以MG患者3 mg/d的常规推荐剂量，CYP3A5*1*1和CYP3A5*1*3型患者可能难以达到治疗窗。因此，CYP3A5基因的检测有利于预测患者的适宜用药剂量。其次，人口学因素方面，本研究结果显示，MG患者的年龄、性别、体重对他克莫司 C/D值的影响无统计学意义。因此，尽管对于移植患者需要按照体重计算给药剂量，但是对于MG患者，是否需要按照体重计算给药剂量有待商榷，仍需要更多研究证实。再次，本研究对合并用药是否影响他克莫司血药浓度进行分析，结果显示，糖皮质激素、他汀类药物、CCB、PPI并未影响他克莫司的C/D比值。这与上述文献关于合并用药影响血药浓度的结果不一致，其原因可能为：本研究为回顾性研究，多个混杂因素影响了单因素的分析；另外，患者合并用药的剂量存在较大差异，特别是糖皮质激素的剂量，如甲泼尼龙从每天4～1000 mg。因此，进一步多重线性回归分析结果显示，用药剂量、CYP3A5基因多态性、合并使用PPI是影响他克莫司血药浓度的因素，而糖皮质激素未影响他克莫司的血药浓度，这与既往研究显示的糖皮质激素可影响他克莫司血药浓度的结果存在差异[9]。其原因可能与这两项研究均未对合并用药剂量进行定量分析有关。因此，开展针对多因素的定量分析可较好地弥补现有研究的不足，例如通过定量药理学研究可较好地解决此问题，该方法可综合患者性别、年龄、体重、遗传基因分型、疾病状况、合并用药等多个变量，定量分析患者的个体差异对血药浓度的影响。对于MG患者，检索到1篇他克莫司群体药代动力学的研究，该研究将MG患者的人口学因素、病生理状态、用药情况等多因素纳入群体药代动力学模型，定量考察各个变量对血药浓度的影响，但是此研究未将影响血药浓度的重要因素-药物基因多态性纳入模型[10]，因此针对MG患者他克莫司的个体化治疗仍需要开展更多研究。

综上所述，本研究结果显示，MG患者他克莫司血药浓度可能与他克莫司剂量、合并用药、基因多态性有相关性。由于影响他克莫司血药浓度的因素较多，如患者肝肾功能等，本研究纳入患者无严重肝肾功能不全者。因此在临床中存在肝肾功能不全者，应给予注意。关于MG患者他克莫司血药浓度的确切影响因素仍需深入研究。