β3受体自身抗体降低心衰大鼠的缺血/再灌注损伤

(山西省心血管病医院，山西 太原 030024)

随着急性心肌梗死溶栓治疗、经皮冠脉血管介入治疗、冠状动脉旁路移植术等方法的建立和推广，显著提高了冠心病的救治成功率，但同时心衰人群越来越多，发生再次心梗的风险增加，因此心脏遭遇二次打击越来越受到人们的广泛关注[1]。心衰患者心肌经历缺血/再灌注损伤时其并发症的发生率和病死率均显著高于心功能正常者。慢性心衰患者机体处于一个新的代谢状态，对缺血/再灌注损伤等刺激的反应不同于左室功能正常者。研究报道，心脏特异性高表达β3AR的小鼠模型中，病理染色并没有发现肥大增生的心肌细胞，也没有心肌纤维化等改变[2]。Wang J等[3]研究表明抗β3AR抗体(β3AA)在压力后负荷的心衰模型中，具有一定的心脏保护作用，但心衰后再经历缺血/再灌注损伤时，β3AA的作用未见报道。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 由山西医科大学动物中心提供的健康雄性Wistar大鼠70只，8～10周龄重量为200～220 g。

1.1.2 试剂 大鼠β3AR细胞外第二环氨基酸序列(中国医学科学院上海生物化学院)；完全氟氏佐剂、不完全氟氏佐剂、小牛血清白蛋白组份V、TTC 2,3,5-氯化三苯基四氮唑、Evan’s blue、吐温20(均购自Sigma)；辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素、生物素化山羊抗大鼠二抗、原位细胞死亡检测试剂盒(均购自北京中杉金桥生物技术有限公司)；GlueB型活化辣根过氧化物酶(济南泰天和生物科技有限公司)；亲和柱试剂盒HiTrap Protein G HP column，MAbTrap Kit(Amersham)；Caspase-3底物Ac-DEVD-pNA(美国Biomol公司)。

1.1.3 仪器 MS2000生物信号记录分析系统(成都泰能公司)；HX-200动物呼吸机(成都太盟科技有限公司)；超低温冰箱(美国Forma公司)；6-0号无创带针缝合线(上海浦东金环医疗用品有限公司)；石蜡切片机(Leica)；96孔酶标板(丹麦Nunc公司)；SpectraMax M2/M2e酶标仪(Molecular Devices Corp，CA, USA)。

1.2 方法

1.2.1 β3AA的制备 选用Wistar大鼠20只，β3AA处理组给予皮下注射人工合成抗原肽段进行免疫，首次免疫时采用背部皮下多点注射，抗原肽段剂量为0.4μg/kg，使用完全佐剂混合，2周后用不完全佐剂与抗体肽段混合加强免疫，以后每隔两周使用不完全佐剂与抗体肽段混合加强免疫1次，共免疫8周。采用改良的ELISA方法检测免疫鼠血清中β3AA水平。利用IgG亲和纯化试剂盒(Mab．Trap Kit)纯化抗β3AA阳性的免疫大鼠血清中的IgG，严格按照试剂盒说明书操作进行。

1.2.2 大鼠压力后负荷型心衰模型制备 采用腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.3 mL/100 g体重)大鼠，在剑突下沿正中线打开腹腔，在左右肾动脉之间分离腹主动脉，将7号针头粗的探针与腹主动脉一并结扎，然后抽出探针，腹腔注射庆大霉素抗感染，分层关腹。

1.2.3 β3AA鼠尾静脉给予心衰大鼠 采用尾静脉注射法将β3AA给予心衰大鼠体内，剂量为2μg/g，每10 d注射1次，共注射5次；对照组以相同的方法给予β3AA阴性的IgG。

1.2.4 缺血/再灌注手术 将大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.3 mL/100 g体重)麻醉，连接心电监护，行气管切开、呼吸机机械通气，设置通气量7～8 mL，呼吸频率为60次/min；开胸暴露心脏，打开心包，将6～0无创缝合线带针穿过左前降支下方，系一活结，观察心电图Ⅱ导联ST-T抬高，松开结扎线，观察抬高的ST-T下降1/2以上。前降支结扎时间为30 min，再灌注时间3 h；假手术组操作相同，但不结扎前降支。

1.2.5 心梗面积测定 再灌注结束后，麻醉大鼠，连接呼吸机，打开胸腔，再次结扎前降支，从股静脉注入2% Evan′s 蓝染料 2 mL，待大鼠四肢末梢皮肤及口唇蓝染后，迅速摘除心脏， -70 ℃冻存。取出冻存心脏，自心底向心尖沿横切面将心脏平均切成厚约2 mm的环形薄片，置于TTC染液中，避光孵育15 min，采用10%甲醇固定24～48 h。

1.2.6 Caspase 3 活性测定、原位末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)测定心肌细胞凋亡 利用Capase3 活性测定试剂盒进行检测，严格按说明书操作。利用原位细胞死亡检测试剂盒检测。每张切片随机选取10个视野，计数视野内凋亡阳性细胞和所有心肌细胞，以凋亡指数反应心肌细胞凋亡的情况。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 β3AA可以改善心衰大鼠经历缺血/再灌注手术后的生存情况

心衰后再经受缺血/再灌注打击，极易引发急性心衰且生存情况不容乐观。而β3AA经鼠尾静脉给予心衰大鼠后，经历缺血/再灌注手术的生存情况明显改善，平均存活时间为155 min，死亡率50%，而给予对照组(给予β3AA阴性的IgG组)平均存时间为21 min，死亡率为87.5%，差异有统计学意义(P<0.05)。见图 1。

图1 β3AA被动免疫心衰大鼠经历缺血/再灌注(I/R)损伤后，生存率明显改善

注：Sham：腹主动脉缩窄术后大鼠+伪I/R手术组；AB+β3AA+I/R：β3AA被动免疫腹主动脉缩窄术后大鼠+I/R组；AB+IgG+I/R：免疫球蛋白被动免疫腹主动脉缩窄术后大鼠+I/R组

2.2 β3AA使心衰大鼠经历缺血/再灌注损伤后心梗面积减小

心肌梗塞面积是反映心肌损伤情况的经典指标。β3AA经鼠尾静脉给予心衰大鼠后，再经历心肌缺血/再灌注时，与对照组比较可明显降低心肌梗死面积，差异有统计学意义(48.81±6.45%vs60.25±2.52%，P<0.05，图2)。提示，β3AA处理的心衰大鼠经历缺血/再灌注后心肌损伤减轻。

图2 β3AA被动免疫心衰大鼠后，经历缺血/再灌注引发的心梗面积减小

注：Sham：腹主动脉缩窄术后大鼠+伪I/R手术组；AB+β3AA+I/R：β3AA被动免疫腹主动脉缩窄术后大鼠+I/R组；AB+IgG+I/R：免疫球蛋白被动免疫腹主动脉缩窄术后大鼠+I/R组；AAR/LV%：危险区面积占左心室面积的百分比；AN/AAR%：心肌梗塞面积占危险区面积的百分比；*P<0.05 vs sham；#P<0.05 vs AB+IgG+I/R

2.3 β3AA可以使心衰大鼠经历缺血/再灌注手术后心肌细胞凋亡减少

TUNEL染色结果及Caspase-3活性检测结果均显示，与对照组相比，β3AA处理的心衰大鼠危险区心肌组织凋亡指数降低，差异有统计学意义(24.33±1.82%vs31.24±1.31%,P<0.05, 图 3A)，心肌组织caspase-3活性降低，差异有统计学意义(1 485±89.39vs1 941±150.0，P<0.05，图3B)。伪手术组凋亡指数为1.32±0.18%，心肌组织TUNEL染色几乎没有阳性的凋亡核。

图3 β3AA被动免疫心衰大鼠后，经历缺血/再灌注引发的心肌细胞凋亡减少

注：A：TUNEL测定结果，B：Caspase3 活性测定；Sham：腹主动脉缩窄术后大鼠+伪I/R手术组；AB+β3AA+I/R：β3AA被动免疫腹主动脉缩窄术后大鼠+I/R组；AB+IgG+I/R：免疫球蛋白被动免疫腹主动脉缩窄术后大鼠+I/R组；*P<0.05vs.Sham；#P<0.05vs.AB+IgG+I/R

3 讨论

本研究发现β3AA处理的心衰大鼠，经历心肌缺血/再灌注时，生存情况明显改善，可能是通过减少心肌细胞凋亡而减小心肌梗死面积，提示β3AA对心衰后的缺血/再灌注损伤具有一定的保护作用。

慢性心力衰竭急性失代偿是心血管疾病死亡的主要原因，且是心衰患者反复住院的直接原因[4]。多数慢性心力衰竭急性失代偿发作的诱因是心肌相当或绝对缺血[5]。因此，本研究探索了经鼠尾静脉直接给予β3AA对心衰大鼠经受心肌缺血/再灌注损伤的作用。研究发现，β3AA处理后，心衰大鼠经受缺血/再灌注损伤后的生存情况明显改善，生存时间明显延长，且心肌损伤情况明显改善，表现在心肌梗死面积减小，心肌细胞凋亡数量减少。缺血/再灌注后心肌细胞的死亡形式有多种，包括坏死、凋亡、自噬等，凋亡因其可调可控而广受关注，通过多种手段以减少心肌细胞凋亡，降低心肌损害，本研究中采用Tunel以及Caspase3活性测定两种方法检测凋亡，均发现β3AA经鼠尾静脉给予心衰大鼠体内，作用约8周后可明显缺血/再灌注损伤导致的心肌凋亡，进而减小心梗面积，发挥心脏保护作用。

β3AA是针对β3AR的特异性抗体，可能通过激活心肌细胞β3AR，进而激活一系列下游信号通路，其可能的机制包括：a)心衰时，心肌细胞表面β3AR较非心衰时表达升高2～3倍，β3AA特异激活β3AR，通过其下游信号转导抑制L2型Ca2+通道，使细胞Ca2+内流减少，内质网等细胞器释放Ca2+，减轻了钙超载，发挥心肌保护作用[6]。b)其次β3AR做为G蛋白偶联受体家族中的一员，与Gi 蛋白相互结合, 从而激活一氧化氮合酶，主要是eNOS，从而使一氧化氮产生增加，发挥扩张血管、改善心脏舒张的作用，增加心脏舒张贮备，改善舒张期冠脉血流，发挥心肌保护作用[7]。c)β3AR不仅存在于心肌细胞中，在血管内皮细胞中也有表达，β3AA特异性激活血管内皮细胞β3AR后发挥扩张血管作用，降低了外周阻力，减轻了心脏后负荷，改善心功能[8]。

总之，β3AA被动免疫可以减轻心衰大鼠的缺血/再灌注损伤，然而β3AA发挥心脏保护作用的具体分子机制尚待进一步研究。