三甲基转移酶SETD2表达下调促进结肠直肠癌细胞的迁移和增殖

崔 昂， 丁家增， 陈海珍， 沈晓卉， 李超飞， 刘国梁

（上海交通大学医学院附属瑞金医院 外科/特需医疗保健中心，上海 200025）

近年来，微卫星不稳定（microsatellite instability,MSI）在结肠直肠癌（colorectal cancer,CRC）发病机制中的地位不断提升。曾有文献报道，电子结肠镜检查未发现明显异常的MSI表型病人，在36个月内发展成CRC[1]。近年有基因测序研究发现，高度MSI的CRC病人，SETD2的移码突变率高达6.7%[2]。TCGA数据库也显示，594例CRC病人有36例（6.06%）SETD2基因的位点发生改变，提示SETD2失活可能是导致体内MSI表型改变的潜在原因之一。本研究通过下调CRC细胞系SETD2表达，观察肿瘤细胞增殖、迁移能力的改变；通过裸鼠成瘤实验下调SETD2表达的肿瘤细胞，研究对肿瘤细胞成瘤能力的影响，和SETD2对CRC发生、发展过程的影响。

材料与方法

一、研究材料和RNA转染

取上海细胞研究所的CRC细胞系SW480及HCT116，培养增殖后用以转染。以pLKO.1为表达载体，构建短发夹 RNA（short hairpin RNA，shRNA）转染用质粒，干扰SW480及HCT116细胞系中SETD2的表达，分为对照组 （pLKO组）及KD组（sh1/sh2组）。并通过mRNA及蛋白质水平实验验证干扰效果。用SETD2 shRNA稳定转染细胞系进行细胞功能实验。

二、Western印迹实验

使用SETD2 shRNA稳定转染后的细胞系提取蛋白质，并通过SETD2及三甲基化H3K36抗体进行Western印迹实验，验证SETD2蛋白质水平变化及其催化产物三甲基化H3K36的蛋白质水平变化。

三、细胞增殖实验

胰酶消化，离心后重悬计数。CRC细胞稀释至 20 000个/mL，充分混匀，加至96孔板，保证细胞密度为2 000个/孔，分为对照组 （pLKO组）及KD组（sh1/sh2组）。每组设置3复孔，包括空白组。24 h后各孔内避光加入promega试剂20 μL/孔，暗箱内反应1 h。1 h后，使用酶标仪490 nm波长检测OD值，各孔与空白孔OD值之差为每孔细胞OD值。其后间隔24 h检测各孔OD值，观察不同组别OD值变化。共观察5 d。

四、细胞划痕实验

取各组对数生长期的稳定转染细胞，消化离心重悬，计数后分别接种8×l05个细胞/孔至6孔板。置于37℃、5%CO2细胞培养箱内培养。待细胞融合接近全满时，用无菌200 μL枪头在6孔板中央划一纵痕。PBS缓冲液轻柔洗去脱落细胞，更换培养基为低血清培养基，继续放入37℃、5%CO2培养箱内培养。36 h后显微镜下观察细胞向缺损中央迁移情况。根据0 h及36 h划痕宽度改变来判断细胞迁移速度及能力。

五、细胞迁移实验

细胞迁移实验是用胰酶消化处于对数生长期的细胞。离心后，1%低血清DMEM培养基重悬。计数后，将细胞稀释为1.2×106个/mL。在transwell上室（24 孔，孔径 8.0 μm）加入 100 μL 细胞悬液，在下室加入600 μL正常DMEM培养基（含 10%FBS）。 在 37 ℃、5%CO2孵箱中培养 12～16 h后。吸除培养基，PBS缓冲液洗涤，棉签擦去上室底膜上层表面的细胞。4%多聚甲醛固定15 min，PBS缓冲液洗涤，结晶紫37℃染色30 min。100倍光镜下，选取四周及中央共5个视野计数，其平均数反映各组细胞的迁移能力。

六、裸鼠成瘤实验

选取3周龄雄性裸鼠。实验前1 d准备SETD2 shRNA稳定转染的SW480和HCT116细胞系，铺板10 cm细胞皿，细胞密度在70%左右。实验当天，使用2.5%胰酶溶液消化细胞，使用2倍胰酶体积、含有10%胎牛血清的DMEM中和，1 000 r/min离心3 min，去除上清液。加入10%PBS缓冲液重悬，1 000 r/min离心3 min。加入少量10%PBS缓冲液重悬，放入无菌消毒离心管中备用。

计数细胞，使细胞密度在1 000万个/mL，取1.5 mL备用。行裸鼠两侧腋下皮下注射，每侧注射0.1 mL上述制备细胞液，即100万个肿瘤细胞。标记裸鼠，每天观察，记录肿瘤出现时间和肿瘤直径。裸鼠肿瘤长至平均直径1 cm时，处死裸鼠、取出肿瘤。

剪开裸鼠表皮，暴露肿瘤。尽可能充分游离肿瘤周围组织。取出肿瘤后称重，剪取肿瘤中心一小块组织。提取RNA分析，与对照组比较肿瘤组织SETD2的表达含量。剩余肿瘤浸泡于多聚甲醛溶液，包埋石蜡切片，使用三甲基化H3K36的抗体进行免疫组织化学抗体染色，研究组织中该蛋白质表达变化情况。

结 果

一、shRNA干扰SETD2的mRNA表达

HCT116和SW480转染SETD2 shRNA，旨在构建SETD2下调的细胞稳系。如图1所示，通过实时PCR的方法验证SETD2的mRNA表达水平。结果表明，2个shRNA序列（sh1/sh2）在2个细胞系中均使SETD2 mRNA表达明显低于对照组（pLKO组）（P＜0.01）。

二、下调SETD2的细胞SETD2和三甲基化H3K36蛋白表达水平的变化

HCT116和SW480中SETD2的mRNA表达水平下调后，Western印迹检测发现SETD2蛋白表达明显下调（β-actin为参照物），其催化产物三甲基化H3K36蛋白表达水平在组蛋白3整体水平不变的情况下明显下调（见图2）。

图1 转染SETD2 shRNA后HCT116和SW480细胞的SETD2 mRNA表达

三、细胞增殖实验

将HCT116、SW480中SETD2下调表达的统称为KD （knock down，sh1、sh2）组。与对照组相比，sh1、sh2 细胞增殖能力明显上升（P＜0.05）（见图 3）。

四、细胞划痕和迁移能力实验

细胞划痕实验中，CRC细胞系SW480，SETD2表达下调后，细胞迁移能力明显提升。第2天，SETD2 KD组（sh1、sh2）划痕接近愈合，而对照组划痕清晰，表明KD组的迁移能力明显强于对照组（见图 4）。

图2 SETD2 shRNA转染后HCT116和SW480细胞系SETD2和三甲基化H3K36蛋白表达

transwell实验中，在100倍显微镜下，48 h后处理细胞，可见KD组结晶紫染色细胞明显多于对照组（见图5）。sh1组穿过transwell小室的细胞数在HCT116和SW480中分别是对照组的1.40倍和1.83倍。sh2组穿过transwell小室的细胞数分别为2.19 倍和 1.93 倍 （P＜0.05）（见图 6）， 表明 SETD2 KD组与对照组相比迁移能力明显增强。

图3 SETD2 shRNA转染后HCT116和SW480细胞增殖变化

图4 SETD2 shRNA转染后SW480细胞系划痕实验

图5 SETD2 shRNA转染后HCT116 transwell实验结晶紫染色（×100倍）

五、SETD2表达对裸鼠成瘤的影响

使用SETD2表达下调的HCT116和SW480细胞系对裸鼠进行皮下注射，记录裸鼠肿瘤发生和生长天数。HCT116细胞系KD组在第11天出现肿瘤，对照组在第13天出现肿瘤。SW480细胞系KD组在第15天出现肿瘤，对照组在第21天出现肿瘤。KD组比对照组肿瘤发生的时间早，KD组肿瘤直径明显大于对照组（P＜0.01）（见图7）。处死小鼠后，取出肿瘤称重，KD组重量明显大于对照组（P＜0.01）（见图 8）。对裸鼠的肿瘤组织中心部分进行取样，提取肿瘤组织RNA。实时PCR检测肿瘤组织SETD2 mRNA表达水平，发现KD组裸鼠肿瘤SETD2表达明显低于对照组（P＜0.05）（见图 9）。

六、裸鼠肿瘤组织三甲基化H3K36蛋白表达情况

图6 SETD2 shRNA转染后HCT116和SW480 transwell实验

图7 裸鼠成瘤实验肿瘤直径

图8 裸鼠成瘤实验肿瘤重量

裸鼠肿瘤组织切片，并用三甲基化H3K36抗体进行免疫组织化学染色。40倍显微镜下观察三甲基化H3K36抗体染色的病理切片，发现对照组裸鼠肿瘤三甲基化H3K36蛋白表达呈强阳性（见图10A），KD组裸鼠肿瘤三甲基化H3K36蛋白表达明显低于对照组（见图10B）。图10C为阴性对照。

图9 裸鼠成瘤实验肿瘤组织SETD2 mRNA表达

讨 论

一、组蛋白H3K36三甲基转移酶SETD2

SETD2蛋白又名KMT3A或HYPB，其编码基因位于第3染色体3p21.31区域。SETD2蛋白是组蛋白H3K36特异性三甲基转移酶，相关分子量为230×103，含SET结构域，也被认为与亨廷顿病相关[3]。体内SETD2与左旋异构核糖核蛋白（hnRNPL）结合成复合物，行使酶的功能，且只影响三甲基化H3K36的表达水平[4]。SETD2的主要结构包含如下：①WW结构域和AWS-SET-postSET三联结构域，负责与H3K36特异性结合，发挥甲基转移酶活性；②一个保守的低电荷区域，富有谷氨酰胺和脯氨酸的转录激活结构域SETD2，通过羧基端与高度磷酸化的RNA聚合酶Ⅱ相结合[5]，但与非磷酸化的RNA聚合酶Ⅱ不相关。SETD2可能是组蛋白甲基化修饰与基因转录调控之间的桥梁。随着对SETD2研究的不断深入，发现其在转录起始的抑制、RNA聚合酶Ⅱ转录延伸、DNA的修复、生物的发育成熟等过程中均发挥重要作用。

TCGA数据库显示，SETD2突变出现在多种肿瘤，包括CRC、散发的肾透明细胞癌、急性白血病、胃癌、肺癌、乳腺癌。SETD2突变导致肿瘤组织三甲基化H3K36表达明显下降。在某些肿瘤中，SETD2突变甚至与病人的预后、肿瘤对化疗的抵抗以及肿瘤的进展分期相关[4-6]。

二、CRC发生、发展过程中SETD2发挥抑癌作用

CRC发生、发展主要是以下两种途径：①染色体不稳定，即遵循“正常黏膜-腺瘤-腺癌”的规律，此途径最早的基因突变一般是APC基因，导致一系列抑癌基因如p53的失活。②DNA错配修复(mismatch repair,MMR)功能异常，DNA MMR功能缺失会导致一种特殊表型，即MSI。

（一）SETD2失活导致三甲基化H3K36表达降低而提高患癌风险

SETD2的羧基端与磷酸化的RNA聚合酶Ⅱ作用，参与基因的转录延伸过程[3]。SETD2既催化组蛋白H3K36三甲基化，又通过羧基端与RNA聚合酶Ⅱ相连，是组蛋白表观遗传学修饰与基因转录调控之间的重要桥梁。

哺乳动物SETD2是H3K36唯一的三甲基化转移酶，产物是三甲基化的组蛋白H3K36（H3K36me3）。SETD2表达下调，导致三甲基化的H3K36表达显著下降[9]，并进一步发生DNA MMR功能缺失，从而表现出MSI的特征。在未检测到MMR基因突变的情况下，SETD2突变失活可能是发生MSI的原因。因此，SETD2被认为是潜在的抑癌基因。本研究CRC细胞系HCT116和SW480，通过shRNA干扰SETD2的表达 （见图1），发现在SETD2蛋白表达下调后，三甲基化H3K36在组蛋白3整体水平不变的情况下明显下调（见图2）。验证之前研究的结果，提示SETD2可能也是CRC的潜在抑癌基因。

图10 免疫组织化学实验裸鼠肿瘤三甲基H3K36蛋白表达

（二）SETD2参与错配基因修复过程

近年来已有很多研究表明，肿瘤的发生与DNA的修复功能缺陷和细胞内异常转录活性升高密切相关。SETD2作为潜在的肿瘤抑制基因，编码的蛋白质对基因修复和抑制细胞内错误转录具有重要作用，是各种SETD2缺失肿瘤发生、发展的重要原因。

三甲基化H3K36对SETD2编码区去乙酰化，继而抑制转录起始的频率。SETD2突变导致三甲基化H3K36表达下降，体内错误转录起始过程明显增多[10]，导致基因转录异常。SETD2与其他在转录延伸中恢复染色体正常结构的因子，如FACT复合物的亚基Spt6发生作用，抑制编码基因内隐藏的转录起始过程[11-12]，保证基因转录的高保真度，从而防止肿瘤的发生。

人体MMR是体内重要的基因修复方式。MMR主要针对基因碱基配对错误和碱基插入丢失进行修复，是人体保证染色体稳定性的自然过程。MMR过程主要通过三甲基化H3K36识别hMutSα（hMSH2-hMSH6）和 hMutSβ（hMSH2-hMSH3）复合体来完成，其体内含量比值为10∶1。表观遗传学修饰对这些MMR基因（包括hMSH2、hMSH6）的影响会导致某些特定肿瘤的发生。在细胞层面，MMR缺陷导致特殊的突变表型，即MSI。因此MSI也被看作MMR缺陷的显著标志。研究表明，SETD2介导的H3K36三甲基化反应特异性结合hMutSα复合物，且有助于hMSH6在染色质内分布定位[13]。细胞内三甲基化H3K36含量G1期开始逐渐升高，S期早期达到峰值，S期末期和G2/M期最低，与hMSH6细胞内含量变化一致。进一步深入研究发现，MMR功能完整的人肺癌细胞系HeLa细胞中下调SETD2的表达，导致三甲基化H3K36表达也下调，且S期hMSH6含量比对照组显著下降，hMSH与三甲基化H3K36的共分布也比对照组显著减少，hMSH染色体定位发生明显改变。SETD2功能缺失导致三甲基化H3K36整体水平下降，特别是S期早期和G2/M期，从而影响细胞内MMR功能。SETD2失活突变的细胞表现出潜在MSI表型，随后细胞突变概率明显上升，最终导致肿瘤发生。Hela细胞中下调SETD2表达，显示出与DLD-1细胞系（缺乏hMSH6的MMR功能缺失的CRC细胞系）相似的 MSI状态[13]。

针对肾透明细胞癌、肺癌、胃癌和血液肿瘤的大规模测序均发现SETD2突变。SETD2缺失的肿瘤病人中，很多未发现MMR相关基因突变和失活。推断SETD2功能失活可能是MMR相关基因正常病人诱发肿瘤的重要原因[6，10，14]。

（三）SETD2参与调节p53转录因子和Wnt细胞通路

研究表明，SETD2选择性调控p53转录因子[15]。SETD2功能缺失导致p53无法被激活，从而增加肿瘤患病风险。小鼠结肠癌模型实验发现，SETD2失活起到关键作用[16]。在稳定的微环境中，SETD2对于正常生理并不是必需的。但一旦机体因辐射、疾病DNA受损、基因失活等影响内环境稳定，SETD2将会激活，并参与启动肠道上皮自我更新和修复，并随着SETD2在细胞内含量的下降，肿瘤发生的风险增加。深入研究证实，SETD2失活上调关键信号转导因子DVL2的表达，表明SETD2可能参与Wnt信号通路的调控，并最终影响肠道上皮重建和肿瘤发生、发展。

SETD2作为H3K36的三甲基转移酶，通过其产物三甲基化H3K36的表达变化，在CRC中引发MSI表型，并参与基因MMR过程。SETD2还作为调节因子调控p53、DLV2的表达，参与Wnt信号通路的调节，对CRC的发生、发展产生影响。本研究表明，SETD2下调抑制CRC细胞系 HCT116及SW480的三甲基化H3K36蛋白的表达，引起细胞功能的变化，导致肿瘤细胞增生及迁移更活跃。裸鼠成瘤实验中导致肿瘤生长更快，肿瘤的重量更大，提示SETD2在CRC中可能通过调控三甲基化H3K36的表达，参与DNA MMR修复过程，是CRC潜在的肿瘤相关基因，对CRC的发生、发展具有重要意义。