串联质谱技术筛查新生儿甲基丙二酸血症回顾性分析*

朱永阑，张春燕，程昱璇，崔佳奕，蒋 涛，檀旭东，桑培培，舒 杨，史文杰，张民杰，田亚平

(中国人民解放军总医院转化医学实验室，北京 100853)

甲基丙二酸血症是先天性有机酸代谢缺陷病中最常见的病种，其发病率较高，危害较大，于1967年首次被报道[1]。该病由甲基丙二酸辅酶A变位酶缺陷或其辅酶钴胺素代谢异常导致甲基丙二酸、甲基枸橼酸、丙酸等代谢物蓄积，进一步造成肾脏、神经、肝脏等多脏器损害[2]。此病多从新生儿或婴儿期开始出现症状,致死率高，临床表现存在个体差异，极易漏诊、误诊[3]，因此，早发现、早治疗非常重要。目前，串联质谱技术因其简便廉价、高通量的特点已广泛应用于新生儿遗传代谢的筛查[4]。本研究采用串联质谱技术筛查2015年10月至2017年12月在中国人民解放军总医院进行新生儿筛查的样本，现对这部分样本应用串联质谱筛查甲基丙二酸血症，结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 2015年12月至2017年12月在中国人民解放军总医院转化医学实验室进行新生儿48项遗传代谢病筛查样本近10万例，样本来自四川、贵州、湖北、西藏、新疆、北京，所有参与筛查者家长均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1液相串联质谱分析 参照文献[5],利用非衍生化串联质谱试剂盒(美国 PerkinElmer公司)完成样本上机前处理。利用Waters TQ Dectctor串联质谱仪对样品进行检测，用 Masslynx.V4.0软件(美国 Waters 公司)处理数据。将数据上传至新生儿疾病筛查系统(杭州博圣公司定制)，通过检查和审核生成报告。其中样本的置信区间是以人群指标浓度分布的0.5%～99.5%作为临床判读截断范围。

1.2.2气相色谱质谱分析 参照文献[6]中的方法对尿液样本进行处理和检测。所用仪器为Thermo fisher公司的气相色谱质谱联用仪(TSQ 8000 Evo)。

1.2.3基因突变分析 本文筛查样本采用全外显子测序技术进行基因突变分析。流程：核酸提取-超声打断-文库构建(TruSeq DNA Sample Preparation 试剂盒)-捕获全外显子区域(Roche NimblegenSeqCap EZ v5.1试剂盒)-illumina平台高通量测序-数据分析(CNV/SV 数据经in house cohort、1000 Genomes及公开CNV 数据库数据过滤携带率，使用Langya注释)。

2 结 果

2.1疑似阳性样本信息 近10万份筛查样本中甲基丙二酸血症、丙酸血症疑似阳性样本信息见表1。本实验室丙酰基肉碱(C3)参考范围为0.30～4.00 μmol/L，丙酰基肉碱/乙酰基肉碱(C3/C2)参考范围为0.03～0.24 μmol/L。共召回132例疑似甲基丙二酸血症、丙酸血症样本，其中C3增高(4.52～10.72 μmol/L)62例(男36例，女26例)，C3/C2增高(0.28～0.44 μmol/L)10例(男8例，女2例)，C3增高(4.04～11.42 μmol/L)伴C3/C2增高(0.23～1.55 μmol/L)60例(男33例，女27例)。

表1 甲基丙二酸血症、丙酸血症疑似阳性患儿信息表(n=132)

2.2串联质谱结果分析 串联质谱结果显示，确诊的例1患儿C3=11.63 μmol/L和C3/C2=1.55 μmol/L比值显著增高，符合甲基丙二酸血症、甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症、丙酸血症的代谢特点，需进一步结合尿气相检测和基因检测进行确诊。确诊的例2患儿C3=5.94 μmol/L和C3/C2=0.75 μmol/L比值也增高，符合甲基丙二酸血症、丙酸血症的代谢特点，也需要结合气相色谱质谱联用仪和基因测序进行诊断。

2.3气相色谱质谱结果分析 尿液气相色谱质谱结果显示，例1患儿甲基丙二酸(36.14 μmol/L)、甲基枸橼酸(2.48 μmol/L)指标升高，符合甲基丙二酸血症代谢特征。由于例2在召回确诊前已死亡，未成功召回进行气相色谱质谱联用仪检测，无检测结果。

2.4基因突变结果分析 基因突变结果分析显示，例1患儿MMACHC基因存在c.609G>A和c.658～660del AAG位点杂合突变，且患儿血同型半胱氨酸增高(63 μmol/L,参考值5～20 μmol/L)，确诊为cblC型合并同型胱氨酸血症。例2患儿存在与丙酸血症相关的PCCA(c.1676)和PCCB(c.835dupc)2个基因突变。见表2。

表2 2例患儿基因检测结果

3 讨 论

甲基丙二酸血症是有机酸代谢缺陷病中发病率较高、危害较大的一类常染色体隐性遗传病,在欧美国家的发病率为1/169 000～1/48 000[7-8],我国无确切的统计资料，相关报道显示台湾为1/85 000[9],浙江为1/64 708[10]，上海为1/26 000[11],山东为1/3 920[12],是有机酸血症中最常见的一种类型。本实验室新生儿筛查平台上检测了来自四川、贵州、湖北、西藏、新疆、北京6地近10万例样本。通过串联质谱技术共筛查出132例疑似阳性样本，可疑阳性率约为1.32‰，进一步通过气相色谱质谱和基因测序分析，确诊甲基丙二酸血症1例，发病率约为1/100 000。可疑阳性率远高于发病率，国内外也存在这个筛查假阳性率较高的问题，如何在避免漏诊的情况下使假阳性率减少，提高阳性预测值有待进一步研究。

甲基丙二酸血症主要包括mut0、mut-、cblA、cblB构成的单纯性甲基丙二酸血症和cblC、cblD、cblF构成的血症合并同型胱氨酸血症，且大多为钴胺素有效型[13]。国外研究发现单纯性甲基丙二酸血症发病率远高于甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸[14]，在我国甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症患者占甲基丙二酸血症患者的59.7%[15]，这潜在提示着甲基丙二酸血症具有种族差异性。甲基丙二酸血症合并同型胱氨酸血症主要由cblC缺陷即MMACHC基因突变所致，也是最常见的钴胺素代谢障碍性疾病[16]。本研究中的1例患儿是MMACHC基因突变所致，且确诊患儿血同型半胱氨酸增高(63 μmol/L,参考值5～20 μmol/L)，应为cblC型合并同型胱氨酸血症，这与我国甲基丙二酸血症常见类型报道相符。国内有学者曾对79例中国 cblC缺陷患者进行研究，发现有48.1%的c.609G>A(p.W203X)突变发生率，其次c.658～660del AAG的突变率为13.9%[17]。另有报道16例合并型甲基丙二酸血症患儿基因检测中发现81%的c.609G>A和c.658～660del AAG突变[18]。在本研究中，确诊患儿MMACHC基因存在c.609G>A(p.Trp146Ter)和c.658～660del AAG(p.Lys163del)位点杂合突变，这与报道也相一致。且c.609G>A和c.658～660del AAG曾被报道为致病突变，与甲基丙二酸血症的发生有关,这与确诊患儿的血尿检测结果也相吻合。对该例患儿建议保证足够的天然蛋白质摄入，同时可用钴胺素、叶酸、甜菜碱、左卡尼汀进行治疗[19]。

丙酸血症是丙酰辅酶A羧化酶缺乏引起的丙酸分解代谢异常的遗传学缺陷病，主要以代谢性酮症酸中毒、发育迟缓和惊厥为主要特征,与甲基丙二酸血症有相似的生化特征和临床症状。有研究报道在55例丙酸血症患者中，有20例是通过新生儿筛查确诊的，通过新生儿筛查早期诊断丙酸血症可以降低病死率[13]。本研究中通过串联质谱技术筛查新生儿遗传代谢病，发现的132例疑似丙酸血症样本中确诊了1例，发病率约为1/100 000。遗憾的是本研究这例样本在召回确诊前已死亡，血液液相串联质谱初筛结果提示为甲基丙二酸血症和丙酸血症。笔者对此样本的干血片做测序，发现其PCCA和PCCB基因存在突变，这两基因与丙酸血症有关。这说明单纯应用串联质谱无法准确诊断和鉴别甲基丙二酸血症和丙酸血症，需结合气相色谱质谱检测尿中的甲基丙二酸、3-羟基丙酸的值进行确诊[20]。另外，目前实验室是根据C3、C3/C2的值来判定是否召回复查，从初筛-召回复查-召回确诊整个流程需要5周时间，后期可以考虑开发试剂盒对初筛提示为甲基丙二酸血症、丙酸血症的样本进行二次筛查，尽早对患儿进行确诊，为患儿的治疗争取时间。

本研究利用串联质谱技术筛查了近10万份样本，甲基丙二酸血症、丙酸血症疑似阳性样本132例，进一步结合气相色谱质谱技术和基因测序确诊了1例cblC型合并同型胱氨酸血症患儿，1例丙酸血症患儿。串联质谱技术的应用能够为甲基丙二酸血症的初筛提供参考，需密切结合气相色谱质谱和测序技术鉴别诊断丙酸血症，为疾病的早发现、早诊断、早治疗提供指导。