miRNA-17-5p、miRNA-103-3p及miRNA-144-3p在急性缺血性脑卒中中的表达及诊断价值研究

2020-05-18黄怡颖

国际检验医学杂志 2020年9期

黄怡颖，张健

(海安市人民医院检验科,江苏海安 226600)

急性缺血性脑卒中(AIS)是脑卒中的最常见类型之一，其特点为高患病率、高致残率、高死亡率及高复发率，已经成为严重的公共卫生问题[1-3]。但是目前尚未研发出特效药物对AIS进行有效治疗和控制，因此，深入探索及研究AIS具有重要的临床意义和诊断价值。微小RNA(miRNA)是一类小的单链调节RNA，其通过调节靶mRNA的表达从而广泛参与转录后的生物过程[4-6]。超过60%的人类蛋白质编码基因含有至少一个保守的miRNA结合位点，大多数蛋白质编码基因受miRNA调控[7-8]。近年来已有大量研究证实，AIS患者的病理过程可与血清miRNA的表达密切相关，但具体机制仍需进一步研究[9-11]。本研究通过对比健康人群和AIS患者血清中miRNA-17-5p、miRNA-103-3p及miRNA-144-3p的水平，探索三者在AIS患者中的临床诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料收集本院2017年4月至2018年4月AIS患者50例为病例组。病例组男28例，女22例；平均年龄(52.3±5.8)岁；高血压患者22例，糖尿病患者14例，高血脂患者20例。纳入标准：(1)患者符合全国脑血管病学术会议修正的《各类脑血管疾病诊断要点》中AIS中的诊断标准[12]，同时经头颅CT或MRI检查证实。(2)计算美国国立卫生院卒中量表(NIHSS)评分，评分范围：0～1分为正常或近乎正常；>1～4分为轻度卒中/小卒中；>4～15分为中度卒中；>15～20分为中重度卒中；>20～42分为重度卒中。同时选择本院同期非AIS患者50例作为对照组，并且与病例组年龄、性别等相匹配，排除脑卒中病史、头部手术史等疾病。对照组男25例，女25例；平均年龄(55.1±7.5)岁；高血压患者18例，糖尿病患者16 例，高血脂患者 23 例。2组患者年龄、性别及疾病史方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。本研究已经过本院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2标本采集所有受试者的血液标本均在空腹状态下采集，将受试者的静脉血3～5 mL收集装进试管中，离心后，将获取的血清置于-20 ℃冰箱保存，冻存检测样本以备后续实验检测。

1.3检测方法血清miRNA-17-5p、miRNA-103-3p及miRNA-144-3p的水平均采用实时灾光定量PCR(RT-PCR)进行检测，试剂盒购自上海百蕊生物科技有限公司。所有实验操作均严格遵循试剂盒说明书进行。RT-PCR测量仪购自德国Qiagen公司，小型高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司。首先，提取血清中总RNA，采用去除基因组反转录试剂盒，将待测标本反转录为cDNA，采用RT-PCR进行检测。反应溶液为20.0 μL体系，分别为SYBR GREEN Mix 8.0 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，cDNA 4.0 μL，最后加入无RNA酶水6.4 μL。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，采用38个循环。miRNA-17-5p的上游引物序列为5′-CCA GGA TCC TTT ATA GTT GTT AGA GTT TG-3′,下游引物序列为5′-CGG AAT TCT AAT CTA CTT CAC TAT CTG CAC-3′。miRNA-103-3p的上游引物序列为5′-GAG CAG CAT TGT ACA G-3′,下游引物序列为5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′。miRNA-144-3p的上游引物序列为5′-GGC GTA CAG TAT AGA TGA T-3′,下游引物序列为 5′-GAG CAG GCT GGA GAA-3′。β-actin的上游引物序列为5′-CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3′,下游引物序列为 5′-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3′。本实验的研究结果均采用2-ΔΔCt法换算三者的相对表达量。

表1 2组患者的临床基线资料比较

2 结果

2.12组血清中miRNA-17-5p、miRNA-103-3p及miRNA-144-3p的表达水平比较与对照组相比，病例组血清中miRNA-17-5p、miRNA-103-3p及miRNA-144-3p的水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05),见表2。

2.2血清中miRNA-17-5p、miRNA-103-3p及miRNA-144-3p的水平与AIS临床特征间的相关性相关分析结果显示，血清中miRNA-17-5p、miRNA-103-3p及miRNA-144-3p与AIS患者NHISS评分呈显著正相关，差异均有统计学意义(r=0.605，P=0.000；r=0.667，P=0.000；r=0.710，P=0.000)。见表3。

表2 2组患者血浆中miRNA-17-5p、miRNA-103-3p与miRNA-144-3p表达水平比较

表3 血清中miRNA-17-5p、miRNA-103-3p及miRNA-144-3p的水平与NHISS评分相关性

图1 miRNA-17-5p、miRNA-103-3p、miRNA-144-3p及三者联合对AIS的ROS曲线

表4 miRNA-17-5p、miRNA-103-3p、miRNA-144-3p及三者联合检测ROC曲线下面积

2.3ROC曲线分析采用ROC曲线评价血清miRNA-17-5p、miRNA-103-3p、miRNA-144-3p及三者联合对AIS的诊断价值，结果提示miRNA-17-5p、miRNA-103-3p、miRNA-144-3p及三者联合区分AIS患者与非AIS的曲线下面积分别为0.846(95%CI：0.757～0.935，P=0.000)、0.866(95%CI：0.788～0.945，P=0.045)、0.935(95%CI：0.888～0.982，P=0.001)和0.976(95%CI：0.953～0.999，P=0.000)；灵敏度和特异度分别为84%和92%、84%和88%、92%和86%、92%和94%，见图1、表4。

3 讨论

AIS是一种多生物因子、多信号通路参与的神经系统疾病，具有发病急和预后差的特点，给我国公民带来沉重的精神压力和经济负担[13-15]。虽然已有相关研究证实,超敏C反应蛋白及胶原纤维酸性蛋白可作为AIS的生物标志物，但目前临床中仍未应用AIS的特异性血清标志物[16-19]。同时，随着miRNA参与AIS机制研究的逐渐深入，可通过检测患者外周血液中miRNA表达的变化来监测AIS的发展过程，因此,miRNA极有可能成为AIS新的诊断标志物[20-21]。

近年来，已有研究证实，miRNA-17-5p在自发性高血压性卒中大鼠的血清中显著上升，而miRNA-17-5p也广泛参与脑血管慢性后遗症的病理过程，这些研究结果表明miRNA-17-5p与脑血管疾病密切相关，但具体机制仍然不明[22]。本研究发现AIS患者血清中miRNA-17-5p的水平显著上升，且与脑卒中患者NIHSS评分呈正相关，进一步证实miRNA-17-5p可增加AIS患病风险，这与前期基础研究结果也相一致。

miRNA-103-3p可能通过正向调节靶基因srebf1的表达进而参与肝脏脂质代谢途径，最终可影响代谢综合征的发生发展[23]。而国内研究也表明，miRNA-103-3p可导致心血管疾病的发生发展[24]。本研究结果显示，AIS患者的血清miRNA-103-3p表达水平显著高于对照，笔者认为这可能是由于脑脊液中的miRNA进入患者外周血从而引起血清水平升高。本研究结果表明，miRNA-144-3p水平在病例组显著增加，并且与NHISS评分呈正相关，这一结果表明miRNA-144-3p可能显著增加AIS的患病风险，同时笔者认为这可能通过诱导神经元凋亡从而加剧AIS的发生发展。ROC曲线下面积结果显示，血清中miRNA-17-5p、miRNA-103-3p及miRNA-144-3p对AIS患者具有一定的诊断价值，当联合miRNA-17-5p、miRNA-103-3p及miRNA-144-3p指标时诊断AIS患者的灵敏度达92%，特异度达94%，这一结果提示联合miRNA-17-5p、miRNA-103-3p及miRNA-144-3p三者检测对AIS的诊断具有更小的误诊率和漏诊率，也为临床应用提供了可靠的理论基础。