双黄连联合抗菌药物对广泛耐药肺炎克雷伯菌体外抑菌的研究*

马冬梅，陶庆春，蒋东葵，张一瑶

(北京中医药大学第三附属医院检验科，北京 100029)

肺炎克雷伯菌是目前临床感染常见的病原菌之一。近几年肺炎克雷伯菌耐药菌株检出呈上升趋势[1-4]，耐药菌株的抗感染治疗给临床带来极大困难。本次试验采用肉汤稀释法测定双黄连、头孢哌酮/舒巴坦、亚胺培南、米诺环素单独应用的最低抑菌浓度(MIC)及3种抗菌药物与双黄连联合应用对广泛耐药肺炎克雷伯菌株的MIC，并分别计算联合用药部分抑菌浓度(FIC)指数，比较双黄连与抗菌药物的联合抑菌效果，为临床抗感染治疗提供试验依据。

1 材料与方法

1.1标本来源 标本均来自本院临床患者，采集日期为2016年1月17日至2018年2月18日。经Phoenix100全自动微生物鉴定仪鉴定菌株，参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)M100-S27标准判读药敏结果，分离出广泛耐药肺炎克雷伯菌30株，质控菌为大肠埃希菌ATCC25922。

1.2培养基 试验用血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、M-H肉汤培养基、M-H琼脂培养基，所需培养基均由OXOID公司生产。

1.3试验药物 双黄连粉针剂(1.2 g/瓶，批号：1508110，哈药集团中药二厂)、亚胺培南西司他丁钠(亚胺培南500 mg：西司他丁钠500 mg，批号：M029976，杭州默沙东制药有限公司)、头孢哌酮/舒巴坦(头孢哌酮1.0 g：舒巴坦0.5 g，批号：1539364，美国辉瑞制药有限公司)、盐酸米诺环素(100 mg/粒×10，批号：M33252，惠氏制药有限公司)。

1.4仪器设备 赛多利斯电子分析天平、全自动微生物鉴定药敏分析仪(BD公司，Phoenix100)、麦氏比浊仪、微量加样器、试管若干。

1.5试验方法

1.5.1试验菌液配制 将30株广泛耐药肺炎克雷伯菌试验菌株分纯培养，取纯培养菌落，配置成0.5麦氏比浊，再进行10倍稀释备用。

1.5.2MIC测定 取双黄连粉针剂1瓶(1.2 g)溶于3 mL生理盐水，配制成400 mg/mL的原始浓度药液，进行对倍稀释成7个浓度梯度。再分别取亚胺培南西司他丁钠1瓶(亚胺培南500 mg)溶于5 mL生理盐水配制亚胺培南药物储备液100 mg/mL。头孢哌酮/舒巴坦1瓶(1.5 g)溶于15 mL生理盐水配制头孢哌酮/舒巴坦药物储备液100 mg/mL。盐酸米诺环素1粒(100 mg)溶于10 mL生理盐水配制米诺环素药物储备液10 mg/mL，再分别用微量加样器吸取3种药物储备液，将亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦、米诺环素稀释成试验浓度1 024、1 024、128 μg/mL，然后各组药液进行对倍稀释成7个浓度梯度。按此系列浓度共配制30组药液，取配制好的药液加入无菌试管1 mL，再于各组试管中加入50 μL试验菌液，35 ℃培养24 h，测定双黄连、亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦、米诺环素对30株菌的MIC值。

1.5.3联合抑菌试验 根据30株菌对双黄连、亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦、米诺环素的MIC结果，以每种药物MIC值的2倍为最高浓度，倍比稀释成8个浓度。采用棋盘法设计，分别将双黄连和3种抗菌药物两两混合，每种药液各加0.5 mL，再于每管加入50 μL菌液，35 ℃培养24 h，记录最佳组合效应时的MIC值，分别计算双黄连分别联合3种抗菌药物对30株广泛耐药肺炎克雷伯菌的FIC指数。

1.5.4结果判读 FIC指数=甲药联合的MIC/甲药单用的MIC+乙药联合的MIC/乙药单用的MIC。FIC指数≤0.5表示协同作用，FIC指数>0.5～1.0表示相加作用，FIC指数>1.0～2.0表示无关作用，FIC指数>2.0表示拮抗作用。

2 结 果

2.1药物单用及联合应用MIC结果 双黄连、亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦、米诺环素单用及联合应用MIC值、MIC值范围见表1～4。从表2～4可以看出，双黄连与亚胺培南联合用药以后，MIC值范围比单独用药有所降低；双黄连与头孢哌酮/舒巴坦联合用药以后，MIC值范围与单独用药没有变化，双黄连与米诺环素联合用药以后，MIC值范围相比反而升高。

2.2浓度-累积抑菌百分率曲线 双黄连、亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦、米诺环素单用和联合应用浓度-累积抑菌百分率曲线见图1、2。由图1、2可知，双黄连和头孢哌酮/舒巴坦、米诺环素联合应用与单用相比，浓度-累积抑菌百分率曲线在一定范围内右移，说明双黄连和头孢哌酮/舒巴坦、米诺环素联合应用比单用其MIC值在一定范围内有所升高；双黄连与亚胺培南联合应用与单用相比，曲线明显左移，表明双黄连与亚胺培南联合用药可降低各自的MIC值。

表1 单用以及联用对广泛耐药肺炎克雷伯菌的MIC值

注：*表示两种药物MIC值单位分别是mg/mL和μg/mL。

表2 双黄连、亚胺培南单用及双黄连联合亚胺培南MIC值

表3 双黄连、头孢哌酮/舒巴坦单用及双黄连联合头孢哌酮/舒巴坦MIC值

表4 双黄连、米诺环素单用及双黄连联合米诺环素MIC值

2.3FIC指数分布 药物联合应用对广泛耐药肺炎克雷伯菌FIC指数分布见表5。双黄连和亚胺培南联合应用FIC指数结果显示：FIC指数≤0.5占6.7%，FIC指数>0.5～1.0占53.3%，FIC指数>1.0～2.0占33.3%，FIC指数>2.0占6.7%。双黄连和头孢哌酮/舒巴坦联合应用的FIC指数结果显示：FIC指数≤0.5占0，FIC指数>0.5～1.0占13.3%，FIC指数>1.0～2.0占23.3%，FIC指数>2.0占63.3%。双黄连和米诺环素联合应用的FIC指数结果显示：FIC指数≤0.5占0，FIC指数>0.5～1.0占3.3%，FIC指数>1.0～2.0占30.0%，FIC指数>2.0占66.7%。

图1 双黄连单用及与亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦、米诺环素联合应用浓度-累积抑菌百分率曲线

图2 亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦、米诺环素单用及与双黄连联合应用浓度-累积抑菌百分率曲线

表5 双黄连与亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦、米诺环素联合应用FIC指数分布[n(%)]

3 讨 论

广泛耐药肺炎克雷伯菌给临床治疗带来很大挑战，专家共识指出耐药革兰阴性菌应选用抗菌药物联合治疗方案[5]，目前清热解毒类中药已经被临床广泛应用，其抗菌效果也越来越受到关注[6-9]。

双黄连粉针剂是临床常用的中成药，具有清热解毒、轻宣透邪的功效，并且相关研究表明其具有一定抑菌抗炎作用[10-13]。本次试验从双黄连与亚胺培南、头孢哌酮/舒巴坦、米诺环素单用及联合应用MIC分布范围、浓度-累积抑菌百分率曲线及两药联合应用FIC指数综合分析。结果表明双黄连和亚胺培南联合应用能在一定范围内降低各自的MIC值，30株菌两药联合应用协同作用占6.7%，相加作用占53.3%，联合应用抑菌效果较好。双黄连和头孢哌酮/舒巴坦、米诺环素联合应用后，对广泛耐药肺炎克雷伯菌无协同作用、相加作用仅占13.3%和3.3%，联合抑菌作用较差。双黄连与亚胺培南联合应用明显优于与头孢哌酮/舒巴坦和米诺环素联合应用的抑菌效果。中药联合抗菌药物抑菌机制尚不明确，可能与改变细菌细胞壁、细胞膜通透性、抑制生物被膜形成、改变细菌外排等原因有关[14-16]，具体机制仍需研究。由于本次研究为体外抑菌试验，体外和体内环境不同，不同患者感染病原菌数量不同，药物联合应用对于体内疗效如何及是否有药物配伍不良反应也有待进一步临床研究。

4 结 论

双黄连联合亚胺培南对广泛耐药肺炎克雷伯菌多数表现为协同作用和相加作用，体外联合抑菌作用较好；而双黄连分别与头孢哌酮/舒巴坦、米诺环素联合多数表现为无关作用和拮抗作用，对广泛耐药肺炎克雷伯菌的体外联合抑菌作用较差。