HCY及MTHFR多态性与冠心病易感性的关系

迟洁 宫艳艳 郑霄 杨娜 姚筱

冠心病是指冠状动脉粥样硬化性心脏病，随着吸烟、高血脂、糖尿病和高血压等多种危险因素的影响，其患病率呈逐年升高的倾向。同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是含硫氨基酸的蛋白质代谢的中间产物。相关文献显示，Hcy明显增加血管粥样硬化的风险，进而参与冠心病的发生发展[1]。谢军等[2]研究亦表明，高Hcy血症史心脑血管病发生的独立危险因素。叶酸代谢相关酶亚甲基四氢叶酸还原酶(methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)是Hcy代谢过程的主要蛋白酶，可能受地域、种族等多种因素的影响。MTHFR 基因突变影响MTHFR 酶活性，最终影响Hcy代谢，而关于Hcy及MTHFR多态性与冠心病易感性之间关系的确切结论尚未明确[3]。本研究探讨血浆Hcy及MTHFR C677T、A1298C多态性与冠心病的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院2018年1月至2019年1月期间心内科住院部收治的185例冠心病患者作为病例组，年龄40～86岁，同期选取180例年龄相匹配的非冠心病患者作为对照组。2组在性别比、年龄、体重指数、吸烟史、高血压病史、高脂血症病史和遗传病家族史等一般资料之间的比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组一般资料之间的比较

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准[4]：病例组患者符合冠心病的诊断标准,经冠脉造影证实右冠状动脉、回旋支、左前降支、左主干中血管狭窄>50%。对照组排除冠心病的诊断，全部研究对象均签署知情同意书和伦理志愿书。

1.2.2 排除标准[5]：严重肝肾功能障碍、自身免疫性疾病、心力衰竭、糖尿病、银屑病、硬皮病、贫血、消化道病变、肿瘤、风湿性疾病、甲状腺功能低下、近期服用阿扎立平、避孕药、环孢素、甲氧苄氨嘧啶、甲氨蝶呤、卡马西平、苯妥英钠、维生素B12、维生素B6、叶酸等影响Hcy代谢的药物。

1.3 检测方法

1.3.1 血浆Hcy：全部研究对象采集空腹(禁食12 h)静脉血10 ml置于EDTA抗凝管内，1 h内采用离心转速(3 000 r/min)，离心半径(8 cm)进行离心操作5 min，使用全自动生化分析仪(日立7 600，日本Hitachi公司)通过酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定血浆Hcy水平，严格按照试剂盒(深圳奥萨制药公司)说明书进行操作，正常参考值为1～10 μmol/L。

1.3.2 MTHFR：使用无菌棉拭子在口腔内侧刮拭40次以上，以略鼓起为适宜，采集口腔黏膜上皮细胞，采用反转录酶-聚合酶链锁反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测MTHFR C677T位点、A1298C位点基因型。首先使用核酸提取试剂盒(上海百傲科技公司)提取脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)。PCR引物(MTHFR C677T-上游5’-GAAAAGCTGCGTGATGATG-3’，下游5’-TTGAAGGAGAAGGTGTC-3’，MTHFR A1298C-上游5’-AAGAAGAAGACTTCAAA-3’、下游5’-TGGGGGGA

GGAGCTGAC-3’)。Taqman-MGB 探针基因序列(MTHFR C677T-V2 5’-AATCGGCTCCCGC-3’、MTHFR

C677T-M2 5’-AATCGACTCCCGC-3’，MTHFR A1298C-V2 5’-ACACTTGCTTCACT-3’、MTHFR A1298C-M2 5’-ACACTTTCTTCAC T-3’)。试剂盒和仪器均由美国应用生物系统(Applied Biosystems，ABI)公司提供，使用Taqman-MGB技术检测，对2个位点进行荧光定量PCR反应，体系10 μl(去离子水3.5 μl，Taqman-MGB 探针0.5 μl，Taqman Universal Master Mix 5 μl，20 mg/L DNA模板1 μl)，条件：95 ℃预变性10 min→(92℃变性15 s、60℃退火延长1 min)×20cycles，扩增→(89℃变性15 s、60℃退火延长1.5 min)×30cycles，扩增。在荧光定量 PCR 仪(7900，ABI 公司)的荧光端读取样品孔，软件分析各样本的基因分型。

2 结果

2.1 2组MTHFR位点基因频率分布情况 MTHFR C677T位点基因型主要包括 TT、CT和CC，MTHFR A1298C位点基因型主要包括 CC、AC和AA。病例组MTHFR C677T、A1298C 位点基因多态性的检验结果符合 Hardy-Weinberg 遗传平衡(χ2=1.014、0.501，P>0.05)，对照组检验结果亦符合Hardy-Weinberg 遗传平衡(χ2=0.415、0.741，P>0.05)，表明样本具有群体代表性。病例组MTHFR C677T位点TT基因型频率和T等位基因频率明显高于对照组，CC基因型频率和C等位基因频率明显低于对照组，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)，2组MTHFR A1298C位点CC、AC、AA基因型频率和等位基因频率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、3。

表2 2组MTHFR位点基因频率分布情况 例(%)

表3 2组MTHFR等位基因频率分布情况 例(%)

2.2 2组血浆Hcy水平的关系 病例组血浆Hcy水平明显高于对照组(P<0.05)，按MTHFR C677T基因型分布，2组 TT、CT和CC基因型血清Hcy水平依次降低，TT基因型血清Hcy水平明显高于CT和CC基因型，CT基因型血清Hcy水平明显高于CC基因型(P<0.05)。按MTHFR A1298C基因型分布，CC、AC和AA血清Hcy水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

组别HcyMTHFR C677TTTCTCCMTHFR A1298CCCACAA病例组(n=185)17.54±11.0322.01±13.0116.61±9.96*12.36±8.01*#15.14±6.9416.02±8.0118.58±9.91对照组(n=180)10.85±8.1214.11±5.0111.02±3.98*9.01±4.02*#10.23±4.1510.39±5.2811.17±6.03t值6.5847.6167.0055.0298.1767.9068.601P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

注：与TT比较，*P<0.05；与CT比较，#P<0.05

2.3 Hcy及MTHFR位点基因与冠心病易感性的关系 携带MTHFR C677T TT位点基因型和Hcy>10 μmol/L是冠心病的独立危险因素(OR=2.068，2.154，P<0.001)，携带MTHFR C677T CC位点基因型是冠心病的独立保护因素(OR=0.502，P<0.001)。见表5。

表5 MTHFR位点基因与冠心病易感性的关系

3 讨论

Hcy是蛋氨酸的中间代谢产物，其含量增加导致血管粥样硬化的机制主要包括：(1)通过上调血管内皮细胞Fas，增加血管内皮素-1，导致血管内皮细胞功能障碍。(2)通过氧化自由基、抑制前列环素和一氧化氮的形成，导致血管内皮损伤和高血压。(3)通过诱导祖细胞凋亡、内质网应激和促进胶原纤维形成导致血管平滑肌增生和血管硬化。易志强等[6]研究表明，高Hcy血症是冠心病的独立危险因素。MTHFR是Hcy再甲基化代谢途径的主要蛋白酶，且具有多态性[7]。当MTHFR基因突变可导致酶活性下降，导致Hcy代谢异常而导致血浆Hcy水平增高。相关文献显示，MTHFR多态性与高血压及冠心病具有紧密的关系[8]。而胡晨鸣等[9]研究则表明，MTHFR多态性与冠心病无明显关系。因此，临床上更致力于Hcy及MTHFR多态性与冠心病易感性之间关系的研究。

本研究结果显示，与非冠心病患者比较，冠心病患者血浆Hcy水平明显增高，与陈映慧等[10]结果相一致。Hcy的机体代谢可能受维生素B12、维生素B6、叶酸和MTHFR代谢酶活性等因素的影响[11]。其中MTHFR代谢酶是Hcy代谢途径中的主要蛋白酶之一，其活性下降可能导致血浆Hcy水平明显增高。MTHFR基因突变可能导致酶活性明显降低，Hcy水平明显升高，进而增加冠心病的风险。相关文献显示，MTHFR基因主要包括MTHFR C677T、MTHFR A1298C位点，但研究发现这2个位点基因与冠心病关系的研究结论尚不一致，甚至相反[12]。本研究显示，MTHFR C677T位点基因型主要包括 TT、CT和CC ，其中以CT型所占比例最高，MTHFR A1298C位点基因型主要包括CC、AC和AA，其中以AA型所占比例最高，与相关文献结果[13]一致。进一步研究显示，冠心病患者MTHFR C677T位点TT基因型频率和T等位基因频率较非冠心病患者明显增高，CC基因型频率和C等位基因频率较非冠心病患者明显降低，提示MTHFR C677T位点多态性与冠心病具有紧密的关系，携带T等位基因的人群出现冠心病的风险较高，T等位基因可作为冠心病的易感基因[14]。进一步研究结果显示，MTHFR C677T TT基因型血清Hcy水平明显高于CT和CC基因型，CT基因型血清Hcy水平明显高于CC基因型，与何冠军等[15]研究结果相一致。由此可推断，与携带MTHFR C677T CT、CC位点基因型患者比较，携带TT基因可更明显促使Hcy水平升高，加重冠心病的风险[16]。而本研究就MTHFR A1298C基因型分布进行研究发现，冠心病患者与非冠心病患者2组MTHFR A1298C位点CC、AC、AA基因型频率和A、C等位基因频率比较差异无统计学意义，且CC、AC和AA基因型血清Hcy水平无明显差异，可见MTHFR A1298C基因多态性与冠心病无明显关系，与相关研究结果[17]一致。赵艳梅等[18]研究表明，MTHFR C677T位点基因突变可能导致蛋白酶由于热不稳定所致活性降低，导致Hcy再甲基化代谢异常，最终导致Hcy水平明显增高，增加冠心病的风险。可见Hcy及其代谢酶MTHFR 活性的异常改变是冠心病的易感因素。笔者认为，在冠心病的预防和治疗期间，重视Hcy及其代谢酶(MTHFR)多态性对临床干预方案的制定具有重要的指导作用，但由于冠心病受多种病理因素的影响，在制定临床干预方案期间仍需综合考虑地域、性别、年龄、合并症等因素。因此，MTHFR C677T位点基因多态性可能参与冠心病的发生发展期间。

综上所述，携带MTHFR C677T TT位点基因型和Hcy>10 μmol/L是冠心病的独立危险因素，携带MTHFR C677T CC位点基因型是冠心病的独立保护因素，Hcy升高和MTHFR TT基因广泛分布可作为冠心病的易感因素参与疾病发生发展期间。但由于本研究样本量较少，结果容易出现偏倚，更确切的结论尚有待多中心大样本的研究探讨。