P311蛋白在胃癌组织中的表达及其临床意义研究*

伍桂荣，崔 彬

廉江市人民医院，广东 廉江 524400

原发性胃癌是消化系统最多见的恶性肿瘤，患者早期临床表现轻微、确诊率较低［1］。早期确诊胃癌并判断其恶性程度，是选择合理的治疗方案、优化患者治疗结局的关键，寻找在胃癌发生发展中扮演重要角色的分子也是今年研究的重点。P311是一种新发现的蛋白，目前被发现对非小细胞肺癌细胞的迁移具有一定调节作用，但其在胃癌发生发展中扮演的角色未明确［2-3］。本次研究检测胃癌组织中P311 蛋白的表达，并进一步探讨P311 蛋白表达量对肿瘤细胞恶性生物学行为的影响，以期为远期胃癌诊断及病情判断奠定一定实践基础。

1 资料与方法

1.1 病例资料

选取2017年7月—2019年3月间在廉江市人民医院接受手术治疗的胃癌患者110例作为研究对象，患者本人及家属签署知情同意书。入组标准：（1）经组织病理检查确诊原发性胃癌；（2）首次确诊、未接受系统放化疗；（3）年龄18～80 周岁。排除标准：（1）合并全身感染性疾病；（2）合并严重心肝肾功能不全；（3）合并其他组织脏器恶性肿瘤性疾病。根据肿瘤分期将110例患者分为早中期胃癌组61 例、晚期胃癌组49 例；另取同期在本院进行胃镜检查的浅表性胃炎患者50例作为胃炎组。早中期胃癌组中男性32 例、女性29 例，年龄37～72 岁，平均年龄（56.27±8.95）岁；晚期胃癌组中男性25 例、女性24 例，年龄40～73岁，平均年龄（57.18±8.73）岁；胃炎组中男性27例、女性23 例，年龄35～71 岁，平均年龄（54.39±9.11）岁。三组研究对象的性别、年龄分布差异无统计学意义（P＞0.05），研究获本院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 P311蛋白：取早中期胃癌组、晚期胃癌组患者的肿瘤组织标本，胃炎组患者的病灶区域组织标本。加入蛋白裂解液（上海邦奕生物科技有限公司，货号BB-3221）并研磨组织，悬液于低温离心机（北京时代北利离心机有限公司，货号GTR10-1）12 000 r/min 离心20 min，弃沉淀、保留上层蛋白样本，参照western-blotting 实验步骤（垂直电泳、电转膜、脱脂牛奶封闭、特异性第一抗体孵育、第二抗体孵育、ECL显影）进行操作。使用Image J软件计算蛋白条带的灰度值，设置胃炎组患者组织标本中P311 蛋白表达量为标准值100，计算早中期胃癌组、晚期胃癌组肿瘤组织标本中P311蛋白的相应表达量。

1.2.2 增殖、侵袭、自噬基因mRNA表达：取早中期胃癌组、晚期胃癌组患者的肿瘤组织标本，胃炎组患者的病灶区域组织标本，加入Trizol试剂（上海杰美基因医药科技有限公司，货号GMS12279）裂解细胞，加入0.2 ml氯仿（上海甄准生物科技有限公司，货号ZCH-1350.1）并低温、12 000 rpm/min离心10～15 min，取上层水相。加入等体积异丙醇（上海羽朵生物科技有限公司，YDM8398）沉淀其中总RNA，经75%乙醇（上海鲁汶生物科技有限公司，规格型号LWJSKJ025-608）洗涤后室温（25℃左右）干燥5～10 min。采用紫外光吸收法测定其RNA纯度，经反转录试剂盒（美国Biomiga 科技公司，货号RT021301）合成样品cDNA，反应体系如下：buffer 2 μL、上下游引物各0.2μL、dNTP 0.1μL、MMLV 0.5μL、DEPC 水 5μL、RNA 模板 2μL。具体上下游引物如下：EZH2 上游5’-AGCGTAGTAGGCTACTTGAT-3’，下 游 5’-CGATGATGCCAGACTGAGGA-3’； I2PP2A 上 游 5’-AGCGATGAGCTGATGACGTAG-3’，下游 5’-CGAGGCTGATCGATGAGTAG-3’；CyclinD1 上 游 5’-GCGTGATGCCAATGATGAT-3’，下 游5’-AGCGACGTAGTAGCGATGA-3’；p16上游5’-AGTGCGTACAGTAAGTTGC-3’，下 游 5’-CGTGAACGTAGGAAC-GAAT-3’；ARK5上游5’-AGCTGATGACGATGAGAAC-3’，下 游 5’-CGTAGTAGTAGCAGTAGCAG-3’；Ezrin 上 游5’-AGCGATTAGCCAGATGCAG-3’，下游 5’-CGTAGCTGAACGTAGTAG-3’；Sema3A 上 游 5’-AGTCGAACGTAGAACGTAG-3’，下 游 5’-CGTGATGACGATGAGTAGT-3’；SIRT1 上游5’-ACGTGATGACCGATGATGA-3’，下 游 5’-CGTAGTACGAATGATGAGC-3’；MMP-9 上 游5’-CGTAGTGACGTAGGTAGCGA-3’，下 游 5’-TGACGTAGCAAGACTGAGTA-3’；Beclin1 上游 5’-ACGTGTAACGAACTGATGCA-3’，下 游 5’-CTACGTAGCAACGTAGCA-3’；MAPLC3 上 游 5’-ATGCTGACCGAACTGAGCAGT-3’，下游5’-ACGATGACGATGAGGATCA-3’；LC3上游5’-ACGTGAACCGTAGATGCGAA-3’，下游5’-TGACGTAACGTAGCGATCA-3’。经荧光定量PCR试剂盒（上海泽叶生物科技有限公司，货号ZY-F1987）上述目标基因的mRNA扩增。在计算机软件中获取相应PCR扩增曲线，设置胃炎组患者组织标本中基因mRNA 表达量为标准值100，计算早中期胃癌组、晚期胃癌组肿瘤组织标本中目标基因mRNA的相应表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析，P311 蛋白表达量，增殖基因、侵袭基因、自噬基因mRNA表达量等计量资料均以均数±标准差（）表示，组间比较采用t 检验；相关性分析采用Pearson检验；以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P311蛋白

三组研究对象病灶组织中P311 蛋白表达量差异有统计学意义（P＜0.05）。早中期胃癌组、晚期胃癌组的P311蛋白表达量显著高于胃炎组，且晚期胃癌组的P311 蛋白表达量高于早中期胃癌组，组间差异均有统计学意义（P＜0.05），见图1。

2.2 增殖基因mRNA表达

图1 三组研究对象病灶组织中P311蛋白表达量比较

三组研究对象病灶组织中增殖基因EZH2、I2PP2A、CyclinD1、p16 的mRNA 表达量差异有统计学意义（P＜0.05）。早中期胃癌组、晚期胃癌组的增殖基因EZH2、I2PP2A、CyclinD1 的 mRNA 表达量高于胃炎组，p16 的mRNA 表达量低于胃炎组，且晚期胃癌组上述基因mRNA表达量变化大于早中期胃癌组，组间差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.3 侵袭基因mRNA表达

三组研究对象病灶组织中侵袭基因ARK5、Ezrin、Sema3A、SIRT1、MMP-9的mRNA表达量差异有统计学意义（P＜0.05）。早中期胃癌组、晚期胃癌组的侵袭基因ARK5、Ezrin、SIRT1、MMP-9 的 mRNA 表达量高于胃炎组，Sema3A 的mRNA 表达量低于胃炎组，且晚期胃癌组上述基因mRNA表达量变化大于早中期胃癌组，组间差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.4 自噬基因mRNA表达

三组研究对象病灶组织中自噬基因Beclin1、MAPLC3、LC3 的mRNA 表达量差异有统计学意义（P＜0.05）。早中期胃癌组、晚期胃癌组的自噬基因Beclin1、MAPLC3 mRNA 表达量低于胃炎组，LC3 mRNA 表达量高于胃炎组，且晚期胃癌组上述基因mRNA表达量变化大于早中期胃癌组，组间差异均有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表1 三组研究对象病灶组织中增殖基因mRNA表达量比较（）

表1 三组研究对象病灶组织中增殖基因mRNA表达量比较（）

注：与胃炎组比较，aP＜0.05；与早中期胃癌组比较，bP＜0.05。

组别胃炎组（n=50）早中期胃癌组（n=61）晚期胃癌组（n=49）F P EZH2 100 145.37±20.88a 199.25±24.94ab 20.187 0.000 I2PP2A 100 131.28±14.72a 178.63±22.94ab 16.384 0.000 CyclinD1 100 124.58±14.76a 169.77±20.83ab 17.037 0.000 p16 100 68.25±8.19a 37.92±5.81ab 11.263 0.000

表2 三组研究对象病灶组织中侵袭基因mRNA表达量比较（）

表2 三组研究对象病灶组织中侵袭基因mRNA表达量比较（）

注：与胃炎组比较，aP＜0.05；与早中期胃癌组比较，bP＜0.05。

组别胃炎组（n=50）早中期胃癌组（n=61）晚期胃癌组（n=49）F P ARK5 100 140.93±17.39a 191.76±24.85ab 151.28 0.000 Ezrin 100 137.66±16.09a 178.53±21.62ab 14.095 0.000 Sema3A 100 76.38±9.17a 42.94±6.08ab 10.827 0.000 SIRT1 100 133.28±15.97a 203.48±27.93ab 20.661 0.000 MMP-9 100 138.72±16.88a 183.25±21.74ab 17.384 0.000

表3 三组研究对象病灶组织中自噬基因mRNA表达量比较（）

表3 三组研究对象病灶组织中自噬基因mRNA表达量比较（）

注：与胃炎组比较，aP＜0.05；与早中期胃癌组比较，bP＜0.05。

组别胃炎组（n=50）早中期胃癌组（n=61）晚期胃癌组（n=49）F P Beclin1 100 68.23±8.11a 39.46±5.37ab 10.921 0.000 MAPLC3 100 71.39±8.64a 42.18±5.73ab 9.042 0.000 LC3 100 142.73±17.92a 186.42±22.85ab 13.274 0.000

2.5 相关性分析

胃癌组织中，P311蛋白表达量与增殖、侵袭、自噬基因的mRNA表达量均呈直接相关关系（P＜0.05），见表4。

表4 胃癌组织P311蛋白表达量与恶性分子mRNA表达量的相关关系

3 讨论

P311是新近发现的可能与肿瘤细胞迁移密切相关的蛋白，具体证据如下：（1）P311 基因在胶质母细胞瘤组织呈高表达，且与黏着斑蛋白等迁移相关蛋白存在共定位关系；（2）P311基因在非小细胞肺癌组织中呈高表达，且与癌细胞浸润程度相关；（3）P311可促进创伤肌肉组织中成纤维母细胞的迁移［4-6］。有学者推测，P311 蛋白可能在胃癌细胞的增殖侵袭过程中也发挥重要作用，但目前相关研究开展甚少。本次研究首先对比胃癌组织及浅表性胃炎组织中P311 蛋白的表达差异发现：胃癌组织中P311 蛋白表达量显著高于胃炎组，且晚期胃癌组织中P311 蛋白表达量高于早中期胃癌组织。上述结果说明P311 蛋白高表达参与了胃癌的发生发展，但具体P311 蛋白表达量对胃癌细胞恶性生物学行为的影响有待研究明确。

肿瘤细胞程序性凋亡抑制/增殖活性增强，是恶性肿瘤发生的核心原因，检测增殖相关基因的表达量可客观反映肿瘤恶性程度［7-8］。EZH2 属于多梳蛋白基因家族成员，在多种恶性肿瘤组织中呈高表达，可将PRC2 复合物招募至特定的基因位点并抑制多种抑癌基因表达［9］。I2PP2A基因参与细胞周期调控、DNA损伤修复等多个过程，目前有研究发现，其在胃癌组织中的表达量是正常组织的2倍以上，被认为是肿瘤治疗的潜在靶点之一。CyclinD1是公认的癌基因，其过表达可激活CDK4/CDK6 并降低细胞增殖过程中对有丝分裂原的依赖，造成细胞周期调节失控、细胞增殖异常。p16属于重要的细胞周期调节物，在G1/S期发挥重要的负向调控作用，通过与CyclinD1 竞争性结合CDK4 并组织细胞进入S 期，使细胞周期停滞从而发挥抑制肿瘤细胞增值的作用［10-11］。本次研究对比各组研究对象病灶组织中上述增殖基因的mRNA表达量发现：胃癌组织中EZH2、I2PP2A、CyclinD1 的mRNA 表达量高于胃炎组，p16 的mRNA 表达量低于胃炎组，且随肿瘤分期增加、上述基因的mRNA表达量改变程度加剧，这与既往研究结果基本一致，说明增殖基因表达异常是胃癌发生发展的重要因素。文中进一步经Pearson 检验发现，胃癌组织中P311 蛋白表达量与增殖基因EZH2、I2PP2A、CyclinD1 mRNA 表达量呈正相关，与p16 mRNA 表达量呈负相关，证实胃癌组织中P311 蛋白表达量与肿瘤细胞增殖活性密切相关。

侵袭迁移是肿瘤细胞恶性程度增加、发生远处转移的核心机制，其发生的分子基础是侵袭基因的表达异常。ARK5是Akt的下游信号分子，癌组织血供不足可导致Akt激活及ARK5基因表达增加，促使肿瘤细胞侵袭及转移。Ezrin对细胞黏附、生长、信号转导等过程起调节作用，目前有研究证实其通过上调YAP 表达而促进胃癌细胞转移［12］。Sema3A是3型Semaphorin家族的抑癌成员，可通过多种信号通路抑制肿瘤增殖侵袭，目前已经发生其在多种恶性肿瘤中表达下调甚至缺失。SIRT1在细胞增殖、能量代谢等多个过程中均发挥重要作用，研究表明SIRT1 可阻断p53依赖的转录及凋亡过程，发挥促癌基因的作用［13-14］。MMP-9 是具有分解细胞外基质作用的物质，在肿瘤发生过程中可降低细胞间黏附作用并促使肿瘤细胞远处转移［15-16］。本次研究发现，胃癌组织中侵袭基因ARK5、Ezrin、SIRT1、MMP-9的mRNA表达量高于胃炎组，Sema3A的mRNA表达量低于胃炎组，且晚期胃癌组织中上述基因的异常表达更甚，结合各个基因的生理作用，说明侵袭基因的异常表达直接参与了胃癌的发生及进展。经Pearson检验进一步发现，胃癌组织中P311 蛋白表达量与ARK5、Ezrin、SIRT1、MMP-9 mRNA 表达量呈正相关，与Sema3A mRNA表达量呈负相关，证实胃癌组织中P311蛋白表达量与肿瘤细胞侵袭活性一致。

自噬是在应激状态下细胞自我消化的过程，近年越来越多的研究证实自噬在肿瘤细胞生长、分化等过程中扮演重要角色［17-19］。Beclin1、MAPLC3 属于自噬正向调控基因，其功能缺失以导致自发性肿瘤发生。LC3是自噬体的标志性分子，其介导的自噬作用在多种胃部疾患中均扮演重要角色［20-21］。已经有国内学者的研究指出，LC3 基因在胃癌组织中呈高表达，与胃癌的发生发展密切相关。本次研究对比各组研究对象病灶组织中上述自噬基因的表达量发现：胃癌组织中自噬基因Beclin1、MAPLC3 mRNA表达量低于胃炎组，LC3 mRNA表达量高于胃炎组，且随胃癌恶性程度增加，以上基因的mRNA表达量变化加剧。经Pearson 检验进一步发现，胃癌组织中P311 蛋白表达量与Beclin1、MAPLC3 mRNA 表达量呈负相关，与LC3 mRNA表达量呈正相关，证实P311 蛋白表达量检测可用于胃癌患者的自噬活性判断。

综上所述，胃癌组织中P311 蛋白表达量异常增高，且其具体表达量与肿瘤细胞增殖、侵袭、自噬等恶性生物学行为直接相关。检测P311 蛋白表达量可作为胃癌早期诊断、病情判断等的重要辅助手段，值得在日后临床实践中推广应用。