脂肪酸钙对应激肉鸡氧化还原状态和免疫功能的影响

2020-05-18刘子微朱建津

食品与生物技术学报 2020年4期

王莹，刘子微，朱建津*，蒋蓉

（1.江南大学食品学院，江苏无锡 214122；2.无锡三智生物科技有限公司，江苏无锡 214155）

高密度饲养的广泛应用，使得家禽在饲养过程中面临各种应激。适当应激有利于机体度过短期恶劣环境，但长期慢性应激会使能量过度消耗，激素分泌紊乱，甚至导致疾病的发生[1-3]。机体应激主要表现为以HPA轴（下丘脑-垂体-肾上腺轴）兴奋为主的一系列神经内分泌反应，过度应激使内环境稳态受到威胁，氧化还原失衡，免疫功能紊乱[4-5]。我国在肉鸡饲料中通常添加大豆油和猪油作为脂肪来源，饲料级猪油因成本较低成为更多工厂的选择，但这种猪油通常会出现一定程度的氧化，摄入之后会影响肉鸡正常的生理功能，造成机体应激[6-8]。脂肪酸钙是一种新型的脂肪来源，它可通过油脂加工过程中产生的副产物加含钙化合物制成，常作为过瘤胃脂肪来源用于反刍动物日粮中[9]。有研究者发现脂肪酸钙可以代替部分油脂作为肉鸡的能量补充饲料，不影响生产性能指标，同时可降低饲料的生产成本,是较为理想的饲料油脂替代品[10]。但脂肪酸钙与甘油三酯结构不同，在体内的消化过程也不同，其对肉鸡机体氧化还原状态和免疫功能的影响未见报道[11]。因此，作者在肉鸡基础日粮中添加脂肪酸钙，研究其对应激肉鸡氧化还原状态和免疫功能的影响，为脂肪酸钙在黄羽肉鸡日粮中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

豆油为市售食用级4级大豆油，PV值3.93，猪油为市售饲料级猪油，PV值10.62，脂肪酸钙为大豆油脂肪酸钙，纯度为80%，脂肪质量分数75%，钙质量分数9%。实验动物为1日龄中速三黄肉鸡（浙江绿园禽业有限公司提供），经动物卫生监督所检验合格。

1.2 实验试剂

鸡CRH （促肾上腺皮质激素释放激素）、鸡ACTH(促肾上腺皮质激素)、鸡CORT（皮质酮）试剂盒、鸡IgG（免疫球蛋白G）试剂盒、鸡IgA（免疫球蛋白 A）试剂盒、IL-6（白介素-6）试剂盒、鸡 HSP70（热休克蛋白70）试剂盒：厦门慧嘉生物科技有限公司产品；CAT（过氧化氢酶）试剂盒，MDA（丙二醛）试剂盒，SOD（超氧化物歧化酶）试剂盒：南京建成生物工程研究所产品；总蛋白定量（BCA法）试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司产品。指标测定严格按照试剂盒说明书操作。

1.3 动物分组与饲养

将360羽一日龄中速黄羽肉鸡随机分为4组：正常对照组（Ⅰ组）和应激组（Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组）,每组9个重复栏,每栏10羽。各组饲料中添加的油脂分别为豆油（Ⅰ组）、豆油（Ⅱ组）、饲料级猪油（Ⅲ组）、豆油脂肪酸钙（Ⅳ组）。对照组为平养模式，按常规饲养模式控温，第一周35℃，之后每周降2℃，直至温度维持在24℃。应激模型为高温高密度笼养应激模型，应激组每只鸡占笼位面积约390 cm2，饲养温度维持在35℃。两组都在肉鸡进舍之前，用福尔马林和高猛酸钾对鸡舍进行熏蒸消毒，实验周期63 d，常规免疫和饲养管理。

实验饲料配方：根据三黄鸡的营养需要配制，饲料配方见表1。

表1 基础日粮配方Table 1 Composition of the basal diet

1.4 试验样品采集与测定

63 d实验期结束时，每组随机抽取9羽黄羽鸡，共36羽进行实验各指标检测分析。取静脉血入采血管中，4℃，3 000 r/min离心10 min，取上层血清，-80℃保存备用。取血入抗凝采血管中，4℃，3 000 r/min离心10 min，取上层血浆，-80℃保存备用。取肝脏、空肠、十二指肠加入预冷的生理盐水匀浆制得质量分数10%组织匀浆，离心10 min后取上清液，-80℃保存，用于测定各项生化指标。

1.5 主要试验设备

综合Epoch微孔板分光光度计：美国Biotek公司产品；台式高速冷冻离心机5804R：Eppendorf公司产品；R686VLT超低温冷冻冰箱：美国 INVETRO公司产品；电热压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗仪器仪表厂产品；Mettle Toledo AB204-N电子天平、Mettler Toledo 320pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品；XB70制冰机：美国GRANT公司产品；恒温水浴锅：精宏实验设备有限公司产品。

1.6 数据的处理和统计分析方法

实验数据采用SPSS19.0对数据进行方差分析，结果以平均值±标准差表示，显著水平为P＜0.05，极显著水平为P＜0.01，采用GraphPad Prism 5.01软件作图。

2 结果与分析

2.1 脂肪酸钙对应激肉鸡应激相关指标的影响

由图1可知，与对照组相比，Ⅱ组和Ⅲ组肉鸡血浆 CRH、ACTH、CORT质量浓度显著升高（P＜0.05），且Ⅲ组肉鸡血浆ACTH极显著高于对照组（P＜0.01）。在应激组中，Ⅲ组肉鸡血浆 CRH、ACTH、CORT质量浓度显著高于其他组（P＜0.05），其中血浆CORT质量浓度极显著高于Ⅳ组（P＜0.01）。Ⅳ组肉鸡血浆ACTH、CORT含量显著低于Ⅱ组和Ⅲ组（P＜0.05）且接近Ⅰ组。HPA轴是神经内分泌免疫网络的枢纽，是应激反应的核心反应轴路[12-13]。当应激发生时，HPA轴被激活，机体血浆CRH、ACTH和CORT升高[14-15]。实验结果表明，综合应激使肉鸡HPA轴相关激素质量浓度上升，饲料级猪油加剧肉鸡机体应激状况，而脂肪酸钙能有效地改善肉鸡机体应激状况，并且部分相关激素能恢复至正对照组的水平。

图1 脂肪酸钙对应激肉鸡HPA轴激素的影响Fig.1 Effect of fatty acid calcium on HPA axis hormone in stressed broiler chickens

由图2可知，应激组肉鸡血浆、肝脏和空肠HSP70质量浓度均显著（P＜0.05）高于对照组，其中Ⅱ组和Ⅲ组肉鸡肝脏HSP70质量浓度极显著高于对照组（P＜0.01）。应激组中，Ⅲ组肝脏与血浆HSP70质量浓度显著高于Ⅱ组和Ⅳ组（P＜0.05），Ⅲ组空肠HSP70质量浓度极显著高于Ⅳ组（P＜0.01）；Ⅳ组肉鸡空肠、血浆HSP70质量浓度显著低于Ⅱ组和Ⅲ组（P＜0.05）。热休克蛋白（heat shock proteins,HSPs）是生物在多种应激源作用下均可产生的一组保护性蛋白，用于增强细胞对损害的耐受程度，抵抗过度应激所造成的组织细胞损伤[16]。HSP70是HSPs家族中最重要的一员，在应激状态下的细胞中合成最为显著[17]。实验结果表明脂肪酸钙可抑制机体HSP70的过量表达，缓解过度应激对机体产生的负面影响。

图2 脂肪酸钙对应激肉鸡HSP70的影响Fig.2 Effect of fatty acid calcium on HSP70 in stressed broiler chickens

2.2 脂肪酸钙对应激肉鸡氧化还原状态的影响

如图3所示，与对照组相比，应激组CAT活力显著降低（P＜0.05），Ⅲ组血清CAT活力极显著低于对照组（P＜0.01）。应激组中，Ⅱ组和Ⅳ组血清CAT活力显著高于Ⅲ组（P＜0.05），Ⅳ组肝脏CAT活力显著高于Ⅲ组（P＜0.05），且十二指肠CAT活力极显著高于Ⅲ组（P＜0.01）。CAT可以清除生物体内的过氧化氢，抑制体内羟基自由基的形成，进而提高机体的抗氧化能力[18]。试验结果表明，综合应激使肉鸡体内CAT活力降低，脂肪酸钙可以提高应激肉鸡体内CAT活力。

图3 脂肪酸钙对应激肉鸡CAT活力的影响Fig.3 Effect of fatty acid calcium on CAT activity in stressed broiler chickens

如图4所示，与对照组相比，应激组肉鸡MDA含量升高，Ⅱ组和Ⅲ组血清MDA含量极显著高于对照组（P＜0.01）。应激组中，与Ⅲ组相比，Ⅱ组肝脏和十二指肠MDA含量显著降低（P＜0.05），但血清MDA含量差异不显著。Ⅳ组血清、肝脏和十二指肠MDA含量显著低于Ⅲ组（P＜0.05），肝脏MDA含量显著低于Ⅱ组且与对照组无显著性差异。MDA是脂质过氧化物代谢过程中形成的小分子产物，其含量常被用作机体组织细胞脂质过氧化程度的生物标志物，过量的MDA会引起膜脂、膜蛋白交联，使膜蛋白构象发生改变，影响细胞的各种功能[19-21]。试验结果表明，综合应激使肉鸡体内脂质过氧化程度升高，脂肪酸钙可以改善这种情况的发生。

图4 脂肪酸钙对应激肉鸡MDA含量的影响Fig.4 Effect of fatty acid calcium on MDA content in stressed broiler chickens

如图5所示，与对照组相比，应激组肉鸡总SOD活力降低，Ⅲ组血清、肝脏、十二指肠总SOD活力显著低于对照组（P＜0.05）。应激组中，与Ⅲ组相比，Ⅱ组肝脏和十二指肠总SOD活力显著升高（P＜0.05），但血清总SOD活力差异不显著。Ⅳ组血清、肝脏和十二指肠总SOD活力显著高于Ⅲ组（P＜0.05），肝脏总SOD活力与对照组无显著性差异。SOD是生物体中的最重要的抗氧化酶之一，它可以催化氧自由基链中超氧自由基生成过氧化氢，是机体中天然存在的超氧自由基清除因子，SOD活性的高低反映了组织细胞清除超氧阴离子的能力[19-20]。试验结果表明，综合应激使肉鸡体内SOD活性降低，脂肪酸钙相较饲料级猪油可以提高应激肉鸡体内SOD活力。

图5 脂肪酸钙对应激肉鸡总SOD活力的影响Fig.5 Effect of fatty acid calcium on T-SOD activity in stressed broiler chickens

2.3 脂肪酸钙对应激肉鸡免疫功能的影响

如图6所示，与对照组相比，Ⅱ组血浆、空肠IgG含量显著降低（P＜0.05），Ⅲ组血浆IgG含量极显著降低（P＜0.01），Ⅳ组血浆、空肠IgG含量无显著性差异。应激组中，Ⅱ组空肠IgG含量显著高于Ⅲ组（P＜0.05），Ⅳ组血浆 IgG 含量显著高于Ⅲ组（P＜0.05）。IgG是再次免疫应答产生的主要免疫球蛋白，是机体发生体液免疫的“主力军”，IgG能通过结合补体、中和毒素、增强免疫细胞吞噬功能调节免疫功能，在介导抗体依赖性细胞毒性中也发挥着重要作用[22-23]。实验结果表明，综合应激使肉鸡体内IgG含量下降，脂肪酸钙能提高应激肉鸡体内IgG含量。

图6 脂肪酸钙对应激肉鸡IgG的影响Fig.6 Effect of fatty acid calcium on IgG content in stressed broiler chickens

图7 脂肪酸钙对应激肉鸡IgA的影响Fig.7 Effect of fatty acid calcium on IgA content in stressed broiler chickens

如图7所示，与对照组相比，Ⅱ组血浆IgA、空肠 sIgA含量显著降低（P＜0.05），Ⅲ组空肠 sIgA含量极显著降低（P＜0.01），Ⅳ组血浆IgA、空肠sIgA含量无显著性差异。应激组中，Ⅳ组血浆IgA含量显著高于Ⅲ组（P＜0.05），空肠sIgA含量极显著高于Ⅲ组（P＜0.01）。sIgA是肠道粘膜免疫最重要的免疫效应分子，含量占黏膜相关组织产生所有抗体的80%以上，其独特的分泌成分能阻碍微生物的黏附，从而发挥对粘膜的保护作用[24]。实验结果表明，综合应激使肉鸡体内IgA含量下降，饲料级猪油加剧了IgA含量的降低，脂肪酸钙能提高应激肉鸡体内IgA含量。

图8 脂肪酸钙对应激肉鸡IL-6的影响Fig.8 Effect of fatty acid calcium on IL-6 content in stressed broiler chickens

如图8所示，与对照组相比，应激组肉鸡IL-6含量升高，Ⅲ组血浆IL-6含量极显著升高（P＜0.01）。应激组中，与Ⅲ组相比，Ⅱ组血浆、空肠IL-6含量显著降低（P＜0.05），肝脏IL-6含量差异不显著。Ⅳ组血浆、肝脏IL-6含量显著低于Ⅲ组（P＜0.05），空肠IL-6含量极显著低于Ⅲ组（P＜0.01）。IL-6是机体内皮细胞、上皮细胞以及肥大细胞分泌的细胞因子之一，IL-6可以通过调节结肠上皮细胞电解质分泌、改变内皮细胞通透性引起炎症反应[25-27]。实验结果表明，综合应激使肉鸡体内IL-6含量上升，脂肪酸钙能够缓解应激肉鸡IL-6的升高。

3 讨论

应激反应、机体氧化还原状态、免疫功能三者之间有着密切的关系[28]。免疫功能的变化是应激反应的主要效应之一，免疫反应与HPA轴之间具有双向的交流通路[24]。Tarcic等发现束缚应激导致小鼠胸腺退化，CD4+胸腺细胞亚群减少，胸腺DNA断裂，且内源性糖皮质激素参与了对胸腺的抑制作用[29]。Regnier等发现慢性热应激和冷应激抑制了禽类体外T淋巴细胞的增殖[30]。Hangalapura等认为应激调节细胞免疫和血浆CORT的水平取决于应激的持续时间[31]。严重应激使肉鸡抗氧化能力下降，活性氧代谢失衡，当细胞积累的活性氧超过正常生理代谢所需含量时，活性氧就会通过抑制转录使蛋白质表达异常；从而引起免疫功能的变化[32]。Lin等研究发现，急性热应激可诱导5周龄肉鸡氧化应激，肝脏比心脏更容易发生氧化应激[33]。Zhao等研究发现，应激影响免疫器官中抗氧化酶的活性，急性应激使雏鸡T-AOC活性显著降低，免疫器官中MDA水平升高，Hsps表达水平显着增加[34]。Chi等认为应激通过NF-κB信号通路介导炎症反应，使ROS含量升高引发氧化失衡，其共同作用损害鸡外周血淋巴细胞[35]。本实验中应激导致肉鸡HPA轴相关激素含量上升，体内抗氧化能力降低，免疫功能受损等与前人研究结果一致。

脂肪酸钙与普通油脂消化吸收方式不同，它在胃中分解为游离脂肪酸，在肠道中部分游离脂肪酸合成为甘油一酯，从而发挥乳化剂的作用，提高了脂肪的利用率[36]。过度应激会使脂肪酶活性下降，机体消化吸收能力降低，代谢紊乱[37]，这时脂肪酸钙在消化吸收方式上的不同成为一大优势，增强了肉鸡对脂肪的消化能力，为机体提供充足的能量和必需脂肪酸，提高了肉鸡的抗应激能力。刘艳琴等发现脂肪酸钙对奶牛的热应激有一定的抵抗作用，这种作用与脂肪酸钙的添加量有关[38]。本试验中，Ⅳ组采用的是脂肪酸钙完全替代油脂的饲喂方法，脂肪酸钙部分代替油脂饲喂肉鸡是否会有更好的结果还需进一步实验确定。