不同铵硝比对生菜叶绿素合成的影响

勾启萤，刘 宁，韩莹琰，郝敬虹，刘超杰，范双喜

(农业应用新技术北京市重点实验室/植物生产国家级实验教学示范中心/北京农学院，北京102206)

叶绿素(Chl)是绿色植物叶绿体内参与光合作用的重要色素，叶绿素含量是反映植物光合能力的一个重要指标[2]。参与叶绿素合成与降解的物质种类众多，其中任意一个物质表达量发生变化都有可能引起叶绿素最终合成含量的改变,终引起光合效率下降，产量减少[3]。叶绿素合成途径(简略部分步骤)[4]：L-谷氨酰-tRNA→L-谷氨酰-1-半醛→5-ALA→PBG→羟甲基后胆色素原→尿卟啉III→粪卟啉原III→原卟啉IX→镁原卟啉IX→叶绿素a→叶绿素b。

生菜，叶用莴苣的俗称，菊科莴苣属一年生或二年生草本作物，是现代人们经常食用的叶菜之一[5]。有关不同铵硝比下对生菜叶绿素合成的影响的研究较少，就此通过研究不同铵硝比对生菜叶绿素合成前体与合成酶含量、叶绿素含量的影响，寻找适合生菜生长的铵硝配比。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验于2018年4月至10月在北京农学院植物科学技术学院蔬菜生理生态实验室完成。以‘北散生1号’为试验品种，催芽后幼苗2～3片真叶后置于水培槽中加营养液，定期测定观察与测定营养液情况，并添加水和营养液至原浓度，4～5片真叶后添加不同铵硝比营养液培育。每个处理16株，重复3次。在第8天取样，测定各项指标。

1.2 试验处理

1.3 测试方法

从生菜茎基部将地上部与地下部分开, 用吸水纸吸干植株水分, 电子天平分别称量地上部和地下部鲜质量, 将植株地上部和地下部分别置于105 ℃烘箱中杀青0.5 h，80 ℃烘干24 h至恒重[6]，计算全株含水量，根冠比等数据。

表1 水培营养液各成分配比Tab.1 Distribution ratio of hydroponic nutrient solution

叶绿素含量的测定选用沈伟其的乙醇、丙酮、水混合液浸提法[7]。5-氨基酮戊酸(ALA)的含量,参考Richard的方法[8]；胆色素原(PBG)含量和尿卟啉原Ⅲ(Urogen Ⅲ)的含量,参考Bogorad的方法[9]；原卟啉IX( ProtoⅨ)和原叶绿素酸(Pchl)的含量,参考Hodgins的方法[10]。δ-氨基酮戊酸脱水酶 (ALAD)的活性，参考Mauzerall和Granick的方法[11]；尿卟啉原合成酶(UROS) 的活性,参考范军和郭蔼光的方法[12]；胆色素原脱氨酶(PBGD)的活性，参考Francesca Granata的方法[13]；原卟啉原氧化酶(PPO)的活性，参考薛金金等的方法[14]。

采用Excel 2014 软件作图，数据采用SPSS25.0软件进行新复极差分析。

2 结果与分析

2.1 不同铵硝比对生菜生长的影响

由表2可看出，铵硝比为25∶75时地上部鲜质量最大，铵硝比为75∶25最少，与其他处理间差异性显著，其中铵硝比为75∶25较25∶75时的质量少了13.4%，地下部鲜质量与地上部鲜质量的差异较相似，均为铵硝比为25∶75时质量最大，差异为完全铵态氮配比与铵硝比为75∶25时的地下部鲜质量间差异不显著，与其他三个不同铵硝比处理间差异显著，其中铵硝比为75∶25时生菜的质量最小，较铵硝比为25∶75时少了62.9%；不同铵硝配比下的地下部干质量为铵硝比为25∶75时最大， 75∶25与50∶50时最小，且与其余的处理差异显著，铵硝比为75∶25时较25∶75时少了54.4%；地上部干质量与全株干质量均为铵硝比为25∶75时最大，铵硝比为50∶50时最小，且有显著性差异；不同处理下全株鲜质量，铵硝比为25∶75时最大，铵硝比为75∶25时最小，且有显著性差异。相对含水量的差异与干鲜质量的趋势相反，铵硝比为25∶75时最少，50∶50时含水量最高，比铵硝比为25∶75时高了2.88个百分点，且差异显著。不同铵硝比下根冠比的数值差异情况与干鲜质量一致，其中铵硝比为25∶75时最大，铵硝比为75∶25最小，铵硝比为25∶75与75∶25处理间差异显著，且所有处理间差异均显著。总的来说，铵硝比为25∶75时生菜的生长状况最佳，地上部与地下部的干鲜质量均最大，且处理间有显著性差异，其中，铵硝比为75∶25与铵硝比为50∶50时生菜的长势相对较差，较不适于生长。

表2 不同铵硝比对生菜幼苗生长的影响Tab.2 Effect of different nitrogen ratios on the growth of lettuce seedlings

2.2 不同铵硝比对生菜叶绿素含量的影响

从图1可以看出，不同铵硝比下生菜的叶绿素a含量差异较大，其中全硝态氮处理时最多，全铵态氮处理时最少，完全硝态氮处理与完全铵态氮处理间有显著性差异，全铵态氮处理较全硝态氮时少了54.76%，铵硝比为75∶25与50∶50处理间无显著性差异。而叶绿素b不同铵硝配比下为铵硝比为75∶25时含量最高，铵硝比为25∶75时最少，且铵硝比为75∶25时与25∶75时有显著性差异。叶绿素a/b的比值为全硝态氮处理下最高，且与其余处理间均有显著性差异，全铵态氮处理最低，随着硝态氮比例的增加比值变大(铵硝比为25∶75除外,较50∶50时少)，其中，全硝态氮比全铵态氮处理时高了一倍多。不同处理下生菜中的叶绿素总量为全硝态氮处理时最多，全铵态氮处理时最少；且两个配比间有显著性差异，与铵硝比为75∶25、50∶50间无显著性差异。总而言之，叶绿素总量与叶绿素a/b均为完全硝态氮处理最高，完全铵态氮处理最低，且2个处理间有显著性差异。

图1 不同铵硝比对生菜叶绿素a、b与总量的影响Fig.1 Effect of different nitrogen ratios on chlorophyll content of lettuce seedlings

2.3 不同铵硝比对叶绿素合成前体含量的影响

从图2可以看出，铵硝比为25∶75时的5-ALA含量最多，完全硝态氮时的含量次之，铵硝比为75∶25时含量最少，较铵硝比为25∶75时少33.7% ，铵硝比为75∶25时与50∶50间无明显差异。不同铵硝比配比下生菜的PBG含量的变化趋势与5-ALA的相同，随着硝铵比中硝态氮的增加PBG的含量随之增加，铵硝比为25∶75时达到最高，完全硝态氮与完全铵态氮的处理间差异不显著。除铵硝比为25∶75外，其他处理间的尿卟啉原III含量均无显著性差异，随着处理中NO3--N的增加尿卟啉原Ⅲ含量增加，至铵硝比为25∶75时含量最高，与其他处理间差异显著。在不同处理下生菜中原卟啉IX(ProtoIX)的含量在完全硝态氮、完全铵态氮与铵硝比为75∶25时无显著性差异，铵硝比为25∶75时含量最高，75∶25时含量最低。不同铵硝配比下原叶绿素酸含量在铵硝比为25∶75时最高，全铵态氮处理、50∶50与铵硝比为25∶75间无显著性差异，铵硝比为75∶25时含量最少，与其他处理间差异显著，其中，铵硝比为25∶75较75∶25时高了41.32%。由以上分析可知，在铵硝比为25∶75时，ALA、PBG、Urogen Ⅲ、ProtoⅨ、Pchl含量最高，铵硝比为75∶25时含量最少。

2.4 不同铵硝比对叶绿素合成前体关键酶活性的影响

从图3可看出，不同铵硝比下ALAD的活性在铵硝比为25∶75时最高，50∶50时最低，铵硝比为50∶50较25∶75时少了43.10%，且铵硝比为25∶75时与其他处理间差异显著，铵硝比为75∶25与50∶50处理间差异不显著。PBGD活性在不同氮素形态下的活性差别与ALAD的趋势相似，其中两种酶活性趋势的区别之处为铵硝比为75∶25与全硝态氮时的活性多少，铵硝比为75∶25与50∶50间无显著性差异。UROS在不同处理下铵硝比为25∶75活性最大，全铵态氮处理、75∶25时较少。而PPO不同处理下的差别与其他三个酶活性均不同，不同铵硝比下全铵态氮处理的活性最大，与其他处理间差异显著，从铵硝比为75∶25起随着硝态氮比例的增加酶活性变大，其中铵硝比为75∶25最小，全铵态氮处理较75∶25时多了43.12%。总之，ALAD、PBGD、UROS、PPO均在铵硝比为25∶75时最高。

图2 不同铵硝比对生菜叶绿素合成前体含量的影响Fig.2 Effect ofdifferent nitrogen ratios on chlorophyll synthesis precursor content of lettuce seedlings

图3 不同铵硝比对生菜叶绿素合成前体关键酶活性的影响Fig.3 Effect ofdifferent nitrogen ratios on key enzymes activity in chlorophyll synthesis precursors of lettuce seedlings

3 讨 论

不同氮素处理下的地上部鲜质量、地下部鲜质量、地下部干质量和全株鲜质量均为铵硝比为25∶75时大，铵硝比为75∶25最小；地上部干质量和全株干质量均为铵硝比为25∶75时最大，50∶50最小，据全株干鲜质量数据分析，干质量比鲜质量数据更具分析性。说明在铵硝比为25∶75时的干物质与鲜物质积累最大，而铵硝比为75∶25时的鲜物质积累较少，干物质积累为铵硝比为50∶50时最少。相对含水量的数据趋势与鲜质量趋势相反，铵硝比为25∶75时最少，铵硝比为75∶25最大，由此说明，铵硝比为25∶75时物质积累量高但含水量小，在生产要求生菜产量高时，铵硝比为25∶75处理较符合要求。不同处理下的根冠比的数据说明铵硝比为25∶75的根系较发达，根际环境较适宜生菜旺盛生长，综合干鲜质量可知在铵硝比为25∶75时生菜的生长情况最好，而铵硝比为75∶25时最差。在王兴萌等的研究中讨论了毛竹实生苗在不同铵硝比情况下的生长状况，其结果为毛竹在铵硝比为25∶75时的地下部长度与表面积等均为最优，与本文结论相似[15]；在唐铭霞等的研究中表面全硝态氮处理时的干物质积累与马铃薯块茎的膨大最有利，与本文结论较有不同[16]。

在某些胁迫条件下，植物内部会通过进行自身生理调节来对抗不良条件，导致部分物质含量的改变，通过研究这些物质的变化以表明植物对于胁迫条件的反应与环境的不良程度[17]，叶绿素含量是衡量每个植物光合作用与内部生长情况的方法[18]，而叶绿素a/b的比值能直接反映植物的光合情况[19]，也能反映叶绿素a向叶绿素b合成情况[20]。本研究中全硝态氮与铵硝比为75∶25时叶绿素总量多，叶绿素a/b为全硝态氮时最高，全铵态氮处理、75∶25、25∶75均较少，全硝态氮时的叶绿素a含量最高而叶绿素b较低，说明在全硝态氮情况下生菜由叶绿素a向叶绿素b合成的过程受到抑制，而其他处理无明显抑制作用；通过叶绿素总量可知铵硝比为75∶25和全硝态氮时光合作用情况最好，铵硝比为25∶75较差，综合生长指标总的说全硝态氮较适宜生菜生长，而铵硝比为75∶25处理下叶绿素合成情况较好但生长情况不佳，较不适宜生长。而在梁娟等的研究结果为全硝态氮时与铵硝比为25∶75时叶绿素情况最好，与本研究结果略有不同[21]。

ALA的合成是叶绿素生物合成途径的限速步骤，叶绿素合成途径大致是从L-谷氨酰-tRNA经过特定反应生成中间物质5-ALA，然后依次生成PBG、羟甲基后胆色素原、尿叶琳III、粪叶琳原III、原卟啉IX、镁原卟啉IX，合成叶绿素a再由叶绿素a生成叶绿素b。其中，若任何一步的合成受到某些因素的影响，受阻部位之前的积累量就会升高，而之后的中间合成体的含量会降低[22]。ALA 是叶绿素和四吡咯环形成的直接前体，也是一个关键的中产物[21]。5-ALA的含量在铵硝比为25∶75时含量最高，在铵硝比为75∶25时含量最少，说明在不同铵硝比下，叶绿素合成开始时的限速物质的含量已有较大差异，铵硝比为75∶25时处于不利状态，重要限速物质含量合成较少，会在一定程度上影响最终叶绿素的含量。

ALA合成之后就要开始叶绿素分子卟啉骨架的构建。ALA依次转变为PBG、羟甲基胆色原,而后异构化形成环状UrogenⅢ，卟啉环侧链再进一步脱羧生成CoprogenⅢ[23]。ALA经过δ-氨基酮戊酸脱水酶(ALAD)催化合成为PBG，其中铵硝比为25∶75的ALAD活性最高，酶活性高有利于后续物质的合成。PBG是卟啉环构建的开始，不同铵硝比下生菜PBG含量说明在铵硝比为25∶75处理下合成最多，铵硝比为75∶25合成效果最不好，含量变化趋势与5-ALA的相同,说明了PBG的合成含量会受5-ALA含量与ALAD酶活性的影响,且不同氮素处理对5-ALA向PBG的合成过程影响差异不大。UrogenⅢ是四吡咯环形成的第一个卟啉中产物[22]。在UrogenⅢ的含量测定中，铵硝比为25∶75含量最多，而其余四组处理的含量无明显差异，与ALA、PBG变化趋势差异较大，由PBG向UrogenⅢ合成的过程中需要PBGD酶的作用，PBGD酶在铵硝比为25∶75时活性最高、铵硝比为50∶50最少，其他处理间差异不大，说明不同氮素对PBG合成到UrogenⅢ的过程影响不同，与PBGD酶活性有关，而酶活性低时会影响后续前体物质的合成[24]；处理铵硝比为75∶25、铵硝比为50∶50 UrogenⅢ的合成含量较多，而其他处理合成与铵硝比为75∶25、铵硝比为50∶50对比相对受阻全铵态氮处理与全硝态氮处理合成较铵硝比为25∶75相比也较为有利；合成过程需要UROS酶作用，而酶活性为铵硝比为25∶75最高，铵硝比为50∶50、全硝态氮处理次之，说明在UrogenⅢ向ProtoⅨ合成的过程中UROS酶活性起较重要的作用。

不同处理下，铵硝比为25∶75时的ProtoⅨ含量最多，但与全铵态氮处理、全硝态氮处理间差异均不显著，而铵硝比为75∶25、铵硝比为50∶50时的含量相对较少，与铵硝比为25∶75有显著性差异，说明从UrogenⅢ开始到ProtoⅨ合成完成的过程中铵硝比为75∶25、铵硝比为50∶50时的合成较之前受阻，而全铵态氮处理与全硝态氮时不受太大影响。而ProtoⅨ作为叶绿素生物合成中较后的中间物质，其含量对最终叶绿素的含量影响很大。由ProtoⅨ合成到原叶绿素酸酯的过程中需要合成许多中间产物，也需要很多关键酶，其中PPO就为其中一个重要的环节，而PPO酶活性为全铵态氮处理最大，而其趋势与原叶绿素酸含量的有部分一致，说明在合成过程中PPO起较重要的作用。

从以上分析可知，在铵硝比为25∶75时，物质积累量高但含水量小，在生产要求生菜产量高时较符合要求；铵硝比为25∶75时的根系较发达，根际环境较适宜生菜旺盛生长，生菜生长情况最好，而铵硝比为75∶25时最差；而叶绿素总量与分量为全硝态氮处理下最适宜生长，铵硝比为75∶25处理下叶绿素合成情况较好但生长情况不佳，较不适宜生长；铵硝比为75∶25叶绿素合成前体与关键酶含量最高，铵硝比为75∶25时含量最少。总的来说，当铵硝比为25∶75和全硝态氮时适宜生菜生长，其中，铵硝比为25∶75最适宜，铵硝比为75∶25最不适宜生菜生长。