巴尔吡尔对常见病原菌体外杀菌作用

徐 珺,董 恒,刘星云,宣秋希,侯晓林

(北京农学院 动物科学技术学院，北京100026)

巴尔吡尔( Ionized Alkali Mineral Complex，IAMC)是一种复合碱性负离子群，是巴尔麦氏的核心成分[1,2]。巴尔麦氏是一种具有活化增效生理作用的复合碱性负离子群及微生态制剂，具有活化组织细胞、促进生长、调节胃肠道、提高免疫性能的功效，临床上常用作为生物饲料添加剂使用[3-5]。作者通过研究巴尔吡尔对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大肠杆菌(Escherichiacoli)的杀菌效果，探索巴尔吡尔体外杀菌作用，为该产品的推广使用提供科学依据。巴尔麦氏是采用美国专利和细胞代谢技术而生产的一种多功能碱性阳离子免疫增强剂，于2013年在中国获得发明专利[6]。其核心物质巴尔吡尔是一种国际上普遍应用的饲料添加剂，其主要成分是活性矿物质、强效电解质、复合还原糖以及益生素等，可以维持动物体内环境的弱碱性、增强动物细胞代谢、促进动物消化吸收、增强免疫细胞的吞噬功能、提高机体非特异性免疫功能[7,8]。研究表明，巴尔吡尔对畜禽体外细菌具有良好的抑制作用，可以改善畜禽生长性能，提高畜禽的经济效益[1]；在饲料中添加巴尔吡尔可以提高奶牛的采食量和产奶量，有助于缓解奶牛热应激[9]；在仔猪饲料中添加巴尔麦氏可以提高保育仔猪的消化能力，改善免疫功能，提高仔猪育成率[10]。目前，大部分文献主要研究巴尔吡尔作为饲料添加剂使用，在其抗菌方面的研究尚有空白，因此，巴尔吡尔的抗菌作用有待进一步研究。

1 材料与方法

1.1 材 料

巴尔吡尔溶液(批号为20180603)，由北京金娜尔生物技术有限公司提供。新洁尔灭消毒剂(批号为20180102)，由山东安捷高科消毒科技有限公司提供。灭菌生理盐水(批号为20180211)，由石家庄四药有限公司提供。

金黄色葡萄球菌ATCC 29213和大肠杆菌ATCC 25922由北京农学院动物医学系实验室保存提供。

MH琼脂培养基、MH肉汤培养基、LB肉汤培养基、平板计数PCA培养基，均由北京奥博星生物技术有限责任公司生产。

1.2 方 法

复苏冻存管中保存的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。用接种环蘸取适量菌液，采用三线画法涂布在MH和LB琼脂板上，于37 ℃恒温培养箱中进行过夜培养。从平板上挑选出一株形状圆润、边缘规整的菌落，用洁净的接种环进行挑菌并分别接种到MH肉汤和LB 肉汤中，振荡试管，使金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均匀地分散在培养基中[11]。将试管放置在37 ℃的摇床上培养16～18 h，4 ℃保存，作为试验菌种以待备用。

试验前对菌液进行细菌计数。从试管中吸取1 mL菌液放到1.5 mL的EP管中3 000 r/min离心5 min，弃掉上清液，保留菌体。向EP管中加入1 mL生理盐水并用移液枪进行混悬，使细菌均匀分布。采用倍比稀释法，将菌液稀释106倍，从稀释过的菌液中吸取20 μL滴在琼脂板上，每个琼脂板滴4滴，倒置于37 ℃恒温培养箱中进行培养，8 h左右进行细菌计数[12]，公式：含菌数CFU/mL=两滴菌液含菌量的平均数×5×稀释倍数。

菌悬液浓度为(107～108) CFU/mL。实验前用无菌生理盐水将菌液稀释至该浓度，4 ℃保存，作为验菌液以备待用。

杀菌试验共使用3个浓度梯度的巴尔吡尔药液。按照巴尔吡尔药液说明书，用无菌生理盐水按1∶2、1∶3和1∶4的比例进行稀释得到3倍、4倍和5倍稀释液。空白对照使用生理盐水，阴性对照选用新洁尔灭,按照说明书进行稀释使用。

向无菌试管内分别加入0.5 mL菌悬液、0.5 mL不同浓度的巴尔吡尔溶液(空白对照为生理盐水，阴性对照为新洁尔灭)，立即混匀。在药物分别作用5 min和10 min时，取 0.1 mL样液用生理盐水稀释106倍，吸取稀释的菌液20 μL涂布MH琼脂培养基和LB琼脂培养基，在37 ℃恒温培养箱内培养20～24 h进行活菌计数。

2 结果与分析

巴尔吡尔对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的杀菌结果，见表1。由表1可知巴尔吡尔对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有杀灭作用，其中原液和稀释3倍的巴尔吡尔的杀菌效果最好。由表2可知，不同浓度的巴尔吡尔作用不同时间对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌杀菌作用不同，巴尔吡尔对金黄色葡萄球菌均有杀菌作用，原液和稀释3倍的巴尔吡尔液体对大肠杆菌有较好的杀菌作用，在药物作用10 min时，无细菌生长，巴尔吡尔对金黄色葡萄球菌的杀灭效果达到99%。

表1 活菌计数法体外杀菌试验结果

Tab.1 Results of bactericidal test in vitro by viable organism counting method

试验药物Drug菌株Strain金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus大肠杆菌Escherichia col原液stock solution--药物稀释3倍drug dilution 3 times--药物稀释4倍drug dilution 4 times-+药物稀释5倍drug dilution 5 times-+空白对照Blank control++阴性对照Negative control--

注：+号表示细菌生长，-号表示细菌不生长

不同稀释倍数的巴尔吡尔对同一株菌的杀菌作用不同。由平板计数法测得随着稀释倍数增加，巴尔吡尔杀菌作用下降。其中原液的杀菌效果最好，杀菌率为100%，另外稀释3倍的巴尔吡尔与原液杀菌作用相差不大，杀菌率高达99.9%。分析原因，巴尔吡尔稀释倍数增加杀菌率降低可能因为稀释后原液的pH值下降、碱性离子浓度降低。同一稀释倍数的巴尔吡尔作用不同时间对同一株菌的杀菌作用不同。巴尔吡尔对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有杀菌作用，但作用时间长比作用时间短的杀菌作用明显，表现为作用10 min的杀菌率高达100%，作用5 min的杀菌率低至86%。分析原因，可能和巴尔吡尔释放与细菌或病毒结合的电子的稳定性有一定关系。

表2 不同浓度巴尔吡尔作用不同时间体外杀菌率Tab.2 In vitro bactericidal rate of different concentrations of balpil at different time

3 讨 论

大量临床试验表明，将巴尔麦氏( 巴尔吡尔) 作为饲料添加剂使用，对畜禽具有很好的降低腹泻率、减少死胎率、提高饲料的利用率、促进生长、增加经济效益的作用，具备广泛应用的临床价值[13,14]。有资料表明，巴尔吡尔是一种碱性复合物，可以与氢离子结合，从而使各种营养物质溶解，同时也可以促进底物与消化酶结合，促进饲料吸收，增加营养的利用率；巴尔吡尔进入体内后通过释放电子与细菌和病毒结合，改变其DNA、RNA的结构，使机体免受细菌和病毒的侵袭，提高畜禽对病原菌的抵抗力。因此，巴尔吡尔常备用作消毒药物[15]；另外，巴尔吡尔含有多种元素和益生菌，这些元素在碱性溶液环境中保持离子状态和水溶性，从而维持动物内环境的弱碱性，碱性离子可以增加骨髓细胞的数量，增加细胞的吞噬功能，提高机体的非特异性免疫功能，而益生菌可以改变畜禽胃肠道内的微生物菌群，减少致病菌数量，增强胃肠道消化、吸收功能，能够作为抗生素有效替代的微生态制剂使用[14,16]。巴尔吡尔对常见病原菌是杀菌机制是：巴尔吡尔富含Si、Ag、Ti、Au、Zn、Fe等碱性离子，可以释放大量电子与细菌结合，从而减弱细菌的活性，实现杀菌的效果。张哲[1]等采用杯碟法和二倍稀释法研究巴尔吡尔对8种畜禽常见病原菌均有较好的抑制和杀灭作用，发现巴尔吡尔对马腺疫链球菌和无乳链球菌抑菌效果最好，其最小抑菌浓度(MIC)为 1∶20，对对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、猪伤寒沙门氏菌、魏氏梭菌和停乳链球菌也有很好的抑制效果，其最小抑菌浓度均为1∶10。