‘粉蝶’胡枝子主要抗氧化物质含量与提取方法

乞心宇 ,杨晓红,2* ,邵聪敏 ,胡亚梅

(1.北京农学院 园林学院，北京 102206；2.北京林果业生态环境功能 提升协同创新中心,北京 102206)

‘粉蝶’胡枝子为豆科胡枝子属新品种，具有花量多、花朵较大、植株粗壮、育性下降，几乎不结实等特性。该品种观赏性强，抗逆性优良，可用于园林观赏、水土保持、动物饲料、医疗保健等多个方面。近些年来，危害人类健康的疾病主要有心脑血管疾病、糖尿病、癌症等，这些疾病虽然病因复杂，但与人体内自由基的过量存在有着一定的关系，而过量的自由基能够引发机体过氧化和脂质代谢异常进而导致人体各种疾病的发生[1]。研究表明，一些营养元素和抗氧化物质可以清除自由基[2-4]。例如，植物中的多酚类、黄酮类化合物、维生素C、维生素E等都具有一定的抗氧化作用，均能有效清除自由基以保护人体健康[5]。

胡枝子别名行军茶，以胡枝子为茶在中国有悠久的历史。据《中华本草》[6]中记载，胡枝子的枝叶具有清热润肺、利尿通淋、止血的功效。经研究，胡枝子可分离出4个黄酮类化合物和3个酚酸类化合物[7]，从中提取出的黄酮类、多酚类物质均是医药保健产品中的重要成分，而这类物质的测定是要在一定的浸提剂种类和浸提方式下完成的[8-9]。鉴于‘粉蝶’胡枝子是从胡枝子中选育出的新品种，具有一定的药用价值和开发保健产品的可能。为了了解‘粉蝶’胡枝子的医药保健价值，本文以‘粉蝶’胡枝子的芽、嫩茎、叶为研究材料，利用紫外可见分光光度计测定各组织中的维生素C、总黄酮、总多酚、原花青素这些抗氧化物质含量，同时研究不同的浸提剂和浸提方式下的总黄酮、总多酚的含量，期望为胡枝子保健产品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为北京农学院培育出的胡枝子新品种‘粉蝶’，栽植于北京农学院胡枝子基地。于2019年5至6月采集发育成熟叶片及枝条顶芽、未木质化的嫩茎。除维生素C 测定用鲜样外，其他测定样品均是将材料置于70 ℃烘干，用粉碎机打磨成粉，过0.355 mm细筛后备用。

1.2 试验方法

1.2.1 维生素C测定 采用紫外分光光度法，参照李军[10]的方法进行操作，243 nm 处测定吸光值。维生素C标准品浓度与相应的吸光值的回归方程y=25.175x+ 0.6439(R2=0.9991)，其中x为吸光度(A)，y为浓度。

1.2.2 黄酮、多酚含量测定

1)材料制备。称取粉碎过筛的干粉0.5 g左右，倒入试管中，设置浸提剂为：95～98 ℃的热水(浸提过程中自然冷却)、75%乙醇、100%乙醇、100%甲醇；浸提方法为：①加入20 mL浸提液，超声提取60 min,离心10 min，分离上清液，残渣再次加入20 mL浸提液，超声提取60 min,离心10 min，分离上清液。合并2次上清液，定容到40 mL。②加入40 mL浸提液，静置14 h，离心10 min，分离上清液，定容到40 mL。③加入40 mL浸提液，120～130 r/min震荡14 h，离心10 min，分离上清液，定容到40 mL。

2)总黄酮含量采用NaNO2-AlCl3-NaOH方法[11]，以槲皮素为标准品，510 nm 处测其吸光度。槲皮素当量浓度与吸光值的回归方程y=591.41x-5.676(R2=0.999 4)，其中x为吸光值，y为浓度。

3)总多酚含量采用Folin-Ciocalteu 比色法测定[12]。以没食子酸为标准品，765 nm下测吸光值，没食子酸当量浓度与吸光值的回归方程y= 1.723 8x-0.028 3(R2=0.999)，其中x为吸光值，y为浓度。

1.2.4 原花青素测定 采用香草醛盐酸法[13]，以儿茶素为标准品，500 nm处测定吸光值。样品原花青素含量回归方程y= 0.100 6x-0.005 7(R2=0.999)。其中x为吸光值，y为浓度。样品粉末先加入正己烷，室温震荡脱脂24 h，将滤渣风干后再用于原花青素测定。

原花青素含量(mg/g)= 标准线查出的浓度值×定容倍数÷样品质量。

以上所有试验重复3次，采用Microsoft excel及DPS软件处理系统进行数据处理。

2 结果分析

2.1 浸提剂种类对‘粉蝶’胡枝子总黄酮和总多酚的影响

4种浸提剂对‘粉蝶’胡枝子叶、芽、茎中黄酮和多酚测定有一定的影响(表1)。75%乙醇为浸提剂时，样品中的总黄酮、总多酚测定值最高，100%的甲醇、95～98 ℃热水也能比较好地浸提出样品中的黄酮、多酚。以100%乙醇为浸提剂时，总黄酮、总多酚测定值最低，且与其他浸提剂的测定值存在显著性差异。对于‘粉蝶’胡枝子叶、芽、茎，当以热水为浸提剂时，其总黄酮测定值可达到最佳浸提剂(75%乙醇)的68.0%～96.4%，其总多酚测定值能够达到最佳浸提剂的57.8%～91.7%。

表1 浸提剂种类对叶中黄酮和多酚的影响Tab.1 Effect of different extractants on total flavonoid cotent and total polyphenol content of leaves

观察值均值±标准差,同列不同字母表示差异显著 (显著性水平P<0.05)

The dataare expressed as the mean ± standard deviation. The different letters indicate significant difference among different treaments (P<0.05)

2.2 浸提方式对‘粉蝶’胡枝子总黄酮和总多酚的影响

2种浸提剂在3种浸提方式下叶中的总黄酮、总多酚含量(表2)结果显示，超声波与震荡14 h对总黄酮、总多酚的测定结果比较好，而静置处理方式对总黄酮、总多酚测定效果较差。静置处理与超声波、震荡14 h处理之间差异显著。静置处理的测定值可达到其他处理方式的56%以上，表明即使用热水浸泡自然冷却静置14 h，也能够溶解出叶片中较多的黄酮、多酚物质。在总黄酮测定值上，震荡14 h的测定值最高，比超声波处理2 h的测定值高了10.2%～19.7%，但是震荡14 h处理与超声波处理之间不存在显著性差异。在总多酚测定方面，当以95～98 ℃热水为浸提剂时，震荡14 h的测定值比超声波处理2 h的测定值尽管高了12.0%，但是两种处理之间也不存在显著性差异；而以75%乙醇为浸提剂时，震荡14 h的测定值比超声波处理2 h的测定值则低了32.5%，且这2种处理方式之间存在显著性差异。

表2 浸提方式对叶中的黄酮、多酚测定影响Tab.2 The effects of different extraction methods on total flavonoid content and total polyphenol content of leaves

2.3 材料处理方式对原花青素含量测定影响

从表3可见，芽、叶、嫩茎脱脂后再进行测定，其测定值显著高于材料未脱脂直接测定数值。对2种处理方式下测得的原花青素含量进行配对2个处理t检验，检验结果表明两者之间存在显著性差异。在2种处理方式下，芽、叶、嫩茎中的原花青素含量均表现为叶中最高，其次为芽，嫩茎中最低，且不同器官中的原花青素含量存在显著性差异。

表3 材料处理对原花青素含量测定影响Tab.3 Effect of material treatment methods on the procyanidin content

2.4 ‘粉蝶’胡枝子不同组织的主要抗氧化物质含量

由测定结果(表3、表4)可见，‘粉蝶’胡枝子的叶、芽、嫩茎中的维生素C、总黄酮、总酚、原花青素含量存在显著性差异。在维生素C、总黄酮、总酚、原花青素含量方面，均表现为叶中最高，其次为芽，嫩茎中最低。从表4的测定值可见，每100 g新鲜叶片中的维生素C含量平均为136.97 mg，嫩茎中也有约63 mg，表明‘粉蝶’胡枝子富含维生素C。这些结果也显示出‘粉蝶’胡枝子每克干物质中含有丰富的黄酮、多酚、原花青素这些抗氧化物质。

表4 ‘粉蝶’胡枝子不同器官中的抗氧化物质含量Tab.4 The contents antioxidants in different organs of L.bicolor ‘Fendie’

3 结论与讨论

研究‘粉蝶’胡枝子中的一些抗氧化物质的含量，对促进其生产应用具有重要意义。维生素C是高效抗氧化剂，可减轻维生素C过氧化物酶的氧化反应[14]。黄酮是植物生长过程中的次生代谢产物，也是许多中草药的有效药用成分，具有十分显著的抗氧化活性[15-16]。多酚是一类广泛存在于植物体内的复杂多元酚类化合物，具有镇痛、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗过敏等多种作用[17-18]。原花青素是被公认为清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂，其抗氧化和清除自由基的能力是维生素E的50倍,维生素C的20倍[19-20]。本次对‘粉蝶’胡枝子叶、芽、嫩茎的新鲜材料进行维生素C测定，对其烘干粉末进行总黄酮、总多酚、原花青素测定，结果表明不同器官中这4类抗氧化物质含量存在显著性差异，且以叶中的含量最高。在嫩茎中，这些物质的含量则是3种组织中最低的，其维生素C、总黄酮、总多酚、原花青素含量不足叶中的一半。通过本次测定，得出其叶中维生素C含量为136.97 mg/100 g，芽中维生素C含量为88.105 mg/100 g，这些测定值高于脐橙的53.01 mg/100 g，甜椒的62.1～63.2 mg/100 g[21]。最优方式下的总黄酮的测定值在叶片中为49.3 mg/g，这与吴洪新等[22]对二色胡枝子叶片总黄酮提取研究中得到的最优状态下提取率为4%的研究结果比较接近，表明测定结果比较可靠。从这4种物质含量上看，‘粉蝶’胡枝子的叶、芽具有较高的开发价值。

在植物体内，黄酮类化合物主要形态为苷类，少部分为苷元。黄酮苷元易溶于甲醇、乙醇、乙醚和乙酸乙酯等有机溶剂或稀碱液，但通常不溶于水。而黄酮苷则与水、甲醇、乙醇和乙酸乙酯等溶剂有着较好的亲和性[23]。绝大多数的多酚物质为水溶性物质，存在于细胞的液泡中。已知的茶多酚、葡萄多酚、苹果多酚可用水、乙醇、甲醇作为溶剂。在多酚的有机萃取中，常用的溶剂有乙醇、甲醇、石油醚、丙酮等[16]。在黄酮、多酚的提取中，广泛使用的方法除了有机剂萃取法外，还有超声波辅助萃取法、微波辅助萃取法、生物酶解萃取法，等等[16，23]。本研究以100%乙醇、100%甲醇、75%乙醇、95～98 ℃热水(热水浸泡后自然冷却)为浸提剂，研究不同提取剂对芽、叶、茎总黄酮、总多酚测定的影响，结果显示出75%的乙醇有良好的浸提效果，而100%乙醇的浸提效果反而不如甲醇与热水。表明黄酮、多酚测定中提取剂种类影响测定结果，这与春花胡枝子的研究结论相同[24]。本次研究采用超声波处理2 h，震荡14 h，静置14 h这3种浸提方式，结果显示出使用75%乙醇或热水作为溶剂时，超声波处理2 h与震荡14 h对叶中总黄酮、总多酚的测定结果基本不存在显著性差异(以75%乙醇为溶剂的总多酚测定结果例外)；而采用静置处14 h，其总黄酮、总多酚的测定值最低。表明 ‘粉蝶’胡枝子总黄酮、总多酚测定受试验中使用的溶剂类型及浸提方式的影响。

原花青素溶于水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等溶剂，有很强的生物活性，如抗氧化活性、防治心血管疾病、抗癌、抗高血压、降血脂、降血糖等[25-26]。原花青素的提取和测定要对原材料进行脱脂处理，常用正己烷、石油醚等进行脱脂处理[27-28]。为了了解材料是否脱脂对原花青素测定的影响，本研究对‘粉蝶’胡枝子的叶、芽、嫩茎的烘干粉末进行了正己烷脱脂处理和未脱脂处理，再采用香草醛法测定材料中的原花青素含量，结果显示出3种材料脱脂后的原花青素含量测定值显著高于未脱脂材料的测定值，表明材料是否脱脂确实影响原花青素测定结果。对于‘粉蝶’胡枝子叶、芽、茎的原花青素含量，表现为叶>芽>嫩茎。

总之，本项研究表明在抗氧化物质测定中，原材料处理方式影响测定结果，植物器官不同，抗氧化物质含量不同，‘粉蝶’胡枝子的叶、芽具有较高开发价值。