羊布鲁氏菌病胶体金抗体检测方法的建立

王海丽 ， 董炳梅 ， 李 芬 ， 许崇友 ， 王金良

(1.聊城职业技术学院农牧科技系 ， 山东 聊城 252000 ； 2.临清润林牧业有限公司 ， 山东 聊城 252000 ； 3.山东绿都生物科技有限公司 ， 山东 滨州 256600 ； 4.日照市东港区动物疫病预防控制中心 ， 山东 日照 276800 ； 5.山东省滨州畜牧兽医研究院 ， 山东 滨州 256600)

布鲁氏菌病(Brucellosis)是一种人兽共患病，严重危害人、畜健康，该病由布鲁氏菌(Brucellasp.)引起，可导致猪、牛、羊等多种动物的不育、流产、关节肿大以及人的反复高热、游走性疼痛，严重危害养殖业的健康发展，并造成了巨大经济损失[1-2]。我国布鲁氏菌病被列为二类传染病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为B类传染病。

目前，我国布鲁氏菌病的法定检测方法是病原学检测与血清学诊断方法，包括凝集试验、补体结合试验、PCR检测和ELISA检测等。凝集试验与补体结合试验均存在非特异性反应、假阳性或前带现象等不足 ； PCR检测与ELISA检测等方法虽敏感性高、特异性强，但需要特殊仪器和实验室环境。因此，以上方法不能满足对布鲁氏菌病的现场诊断与防控需求。胶体金免疫层析(GICA)技术是在免疫渗滤技术基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术，适于临床样本的检测[3]。

布鲁氏菌细胞膜是一个三层膜的结构，其中OMP25在维持外膜结构稳定、细菌毒力等生物学特性方面起到重要作用，是布鲁氏菌的重要膜蛋白之一[4]。本试验在克隆表达布鲁氏菌OMP25蛋白的基础上，进一步开发了布鲁氏菌GICA检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 抗原及血清抗体 羊布鲁氏菌阴性、阳性标准血清，均购自中国兽医药品监察所；大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门菌免疫血清、猪种布鲁氏菌S2株、重组质粒pET-OMP25，均由滨州畜牧兽医研究院制备保存。

1.1.2 主要材料与仪器 金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA，ProSpec公司)；胶体金喷点平台系统(美国Biodot公司，型号：ZX1000)；可编程切条机(杭州峰航科技有限公司，型号：HGS201)；样品垫(玻璃纤维)、硝酸纤维素膜(NCM)、吸水垫及背衬等试纸条组装材料(Millipore公司)；GST标签蛋白亲和层析纯化柱(Amersham Biosciences公司)；透射电子显微镜(Tokyo公司)；BCA法蛋白质定量检测试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司产品)。

1.2 方法

1.2.1 布鲁氏菌外膜蛋白OMP25的表达与纯化 将重组质粒pET-OMP25转化BL21表达菌，37 ℃摇菌培养至OD600 nm值达0.6时，加IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，诱导表达16 h后，进行超声裂解。表达的OMP25蛋白通过亲和柱层析的方法进行纯化，BCA法对纯化后的蛋白浓度进行测定并进行冻干后保存。

1.2.2 胶体金的制备 在容积为500 mL锥形瓶中加入100 mL三蒸水，通过磁力加热搅拌器的方式搅拌加热至沸腾后，加入浓度为1%的HAuCl4溶液1 mL， 持续加热2～3 min后，快速加入1.8 mL 浓度为1%的柠檬酸三钠溶液，待溶液变为亮红色后，继续搅拌加热10 min，自然冷却至室温，用三蒸水补充体积至100 mL，2～8 ℃避光保存备用。

1.2.3 SPA标记pH的确定 溶液的pH对于胶体金颗粒吸附蛋白起到非常重要的作用，在实际的胶体金探针标记中，一般将标记体系的pH调整为高于被标记蛋白等电点(pI)0.5时，即pH=pI+0.5，在这种pH条件下蛋白带正电，结合更稳定。

1.2.4 蛋白标记用量的确定 取10支1.5 mL Ep管，每支加入新制备的胶体金溶液1 mL，然后依次加入不同量的SPA蛋白，混匀后静置5 min，依次向各管中加入0.1 mL 10%(w/v)的NaCl溶液(表1)，充分混匀后室温静置，2 h后观察反应溶液颜色改变情况。当SPA加入量不足时，溶液为蓝色；当SPA蛋白加入适量或过量，溶液则保持颜色不变，即为红色。在探针制备过程中，蛋白的加入量一般为测定最小标记浓度的130%。

1.2.5 SPA蛋白胶体金标记物的制备 将新制备的20 mL胶体金溶液加入至50 mL烧杯中，用0.1 mol/L K2CO3溶液调整pH至1.2.3中确定的pH，缓慢搅拌的同时逐滴加入1.2.3中测定的1.3倍的SPA蛋白用量后，继续搅拌30 min；再加入BSA至终浓度为1%，继续搅拌30 min；2～8 ℃静置2 h后，2 000 r/min离心15 min,弃沉淀,上清以8 000 r/min 再次离心45 min后，弃去上清液，取沉淀用标记洗涤液复溶至原体积；再次以10 000 r/min离心30 min后，用2 mL标记洗涤液复溶沉淀，2～8 ℃避光保存备用。

表1 SPA蛋白标记量的确定

1.2.6 样品垫、金标垫制备 (1)样品垫的制备：切割好的吸水垫用封闭液均匀浸润后，取出平放于37 ℃干燥箱烘干，期间进行翻转2～3次;(2)金标垫的制备：切割好的玻璃纤维膜浸润封闭液后，放入37 ℃干燥箱烘干，期间进行翻转2～3次,浓缩好的金标记物进行4倍稀释后，均匀涂抹在已经进行过封闭的玻璃纤维膜上，进行真空冷冻抽干,抽干后的金标垫室温密封存于干燥环境中，备用。

1.2.7 硝酸纤维素膜(NCM)的处理 将布鲁氏菌标准阳性血清、OMP25蛋白抗原按照筛选的浓度，用点膜仪依次间隔4 mm在NCM上划线，分别作为质控线、检测线，37 ℃干燥后于10% BSA PBS溶液中37 ℃封闭15 min，再次干燥后备用。

1.2.8 胶体金试纸的组装及结果判定 如图1所示，将金标垫、样品垫和吸水垫依次粘贴到硝酸纤NCM上，在NCM上已将检测线和质控线进行了蛋白包被。

结果判定：试纸条的质控线(C线)和检测线(T线)出现肉眼可见的紫红色条带，结果判为阳性；在有效时间内，T线颜色深浅与被检血清中的抗体效价高低呈正相关。C线出现肉眼可见的紫红色条带，而T线无肉眼可见的紫红色条带，结果判为阴性。C线无条带出现则判为无效检测。如中插彩版图2所示。

图1 免疫层析试纸条示意图

1.2.9 检测样品稀释比例的确定 将布鲁氏菌标准阳性、阴性血清，依次用0.85%生理盐水进行10、20、40、60、80倍和100倍稀释，样本最佳稀释倍数根据质控线和检测线的显色深度进行确定。

1.2.10 试纸条特异性检验 用研制的试纸条，依次检测布鲁氏菌阳性血清、布鲁氏菌阴性血清、0.85%生理盐水、大肠杆菌阳性血清、链球菌阳性血清、巴氏杆菌阳性血清、沙门菌阳性血清、葡萄球菌阳性血清。加样量为100 μL，样品稀释倍数依据1.2.9中的结果进行，质控线显色后10 min内进行结果判定。

1.2.11 试纸条敏感性比较 采用试纸条和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法，同时检测倍比稀释后的布鲁氏菌标准阳性血清，比较2种方法的敏感性。

1.2.12 批内与批间的差异性检测 对20份临床血清样品，用3个不同批次的试纸条分别进行布鲁氏菌血清抗体检测，比较分析试纸条检测结果的批间差异性。随机在一个批次的试纸条中取20个试纸条检测卡，检测同一份临床血清样品，评价试纸条检测批内差异性。

1.2.13 保存期试验 20组试纸条，每组10个，密封干燥包装后，分别放在室温和4 ℃保存3个月后，每个月取出5条试纸条，分别评价在室温和4 ℃保存条件下，试纸条的特异性和敏感性的差异情况。

1.2.14 临床检测应用 随机抽取320份从山东、河南等地的送检的羊血清样品，用本试验研制的试纸条检测布鲁氏菌血清抗体。并与购买的布鲁氏菌抗体ELISA试剂盒同时检测随机采集的20份临床血清样品，比较布鲁氏菌抗体ELISA试剂盒和研制试纸条检测结果的符合率。

2 结果

2.1 布鲁氏菌 OMP25蛋白的表达及纯化 将OMP25蛋白表达并纯化后，进行SDS-PAGE检测，结果显示，蛋白大小约为25 kDa，蛋白浓度为1.41 mg/mL，且具有较高的纯度(图3)。

2.2 胶体金的制备 透射电镜对制备的胶体金颗粒进行观测，结果显示，胶体金颗粒较为均一(图4)；制备的胶体金溶液在400～600 nm紫外扫描得到最大吸收峰波长为520 nm(图5)，胶体金颗粒直径约为20 nm，与透射电镜观测值基本相符。

2.3 SPA蛋白标记胶体金溶液的pH 胶体金溶液的pH根据SPA的pI确定。SPA的pI为5.1，在胶体金探针制备中，胶体金调整为pH=pI+0.5。因此，胶体金溶液的pH确定为5.6。

图3 OMP25蛋白的表达与纯化

图4 胶体金颗粒观测图

图5 胶体金溶液在400～600 nm紫外扫描图谱

2.4 SPA蛋白标记物浓度 从中插彩版图6中颜色变化可以看出，加入6 μg SPA蛋白的7号管，再加入10%NaCl后，胶体金溶液颜色未有明显变化，而8号管溶液的颜色变为蓝色，表明7号管SPA量适宜或超量。在实际工作中，加入蛋白浓度一般为测定标记蛋白浓度的1.3倍，因此确定最佳SPA标记物的浓度为7.8 μg/mL。

2.5 检测线和质控线包被浓度的确定 不同的检测线和质控线、包被浓度，对试纸条的特异性和敏感性有很大的影响。经多次试验，通过目测质控线和检测线显色清晰度，最终确定如下条件：检测线包被条件：OMP25蛋白的浓度为1.20 mg/mL，点膜仪参数为Speed 40 mm/sec，1.0 μL/cm；质控线包被条件：羊IgG的浓度为1.60 mg/mL，点膜仪参数为Speed 40 mm/sec，1.0 μL/cm。

2.6 血清样本稀释倍数的确定 通过将多份不同倍数稀释后布鲁氏菌阴、阳性血清及大肠杆菌免疫血清、巴氏杆菌免疫血清、沙门菌免疫血清进行试纸条检测，发现在进行20倍稀释后，血清样本在T线和C线上的显色最为清晰。并且其他血清在进行稀释检测后，未发生非特异性反应。因此，确定20倍稀释为待检样品最佳稀释倍数。

2.7 试纸条特异性检验 结果见中插彩版图7，由图7可知，本试验所制备的布鲁氏菌抗体检测试纸条具有很好的特异性，仅与布鲁氏菌阳性血清发生反应，而与布鲁氏菌阴性血清、0.85%生理盐水、大肠杆菌阳性血清、巴氏杆菌阳性血清、沙门菌阳性血清、链球菌阳性血清、葡萄球菌阳性血清无交叉反应，重复3次，结果相同。可以进行下一步测试。

2.8 试纸条敏感性检验 用制备的试纸条和西班牙INgezim公司的布鲁氏菌病抗体ELISA检测倍比稀释后的布鲁氏菌阳性血清，结果表明，二者的最低检出量均在1∶1 280～1∶2 560，证明2种检测方法的敏感性相近(表2)。

2.9 试纸条临床应用及符合率试验 在临床收集的320份样本血清中，ELISA试剂盒检测的布鲁氏菌抗体阳性率为89.7%，胶体金试纸条检测的抗体阳性率为85.9%。ELISA试剂盒共检测出阳性287份，试纸条共检测出阳性275份；用ELISA试剂盒检测出的33份阴性样品中，利用胶体金试纸条检测出32份阴性样品(表3)。相同样本2种检测方法的符合率为95.9%，敏感性为95.8%，特异性为97.0%。证明该胶体金试纸条的检测结果是可靠的。

2.10 重复性试验和保存期试验 用3个不同批次的试纸条分别检测20份临床血清，结果完全一致，表明研制试纸条的批间差异较小。随机从一批试纸条中挑取的20条，检测同一份临床血清样品，检测结果完全一致，说明试纸条批内无差异。保存期试验表明，在4 ℃条件下保存9个月，试纸条的敏感性和特异性无明显变化，敏感性在试纸条保存10个月时有所降低；在室温条件下保存6个月，试纸条的敏感性和特异性无明显变化，敏感性在试纸条保存7个月时有所降低。结果表明：试纸条在4 ℃条件下密闭保存9个月或室温下保存6个月，其敏感性和特异性不发生改变，可用于临床检测。

表2 间接ELISA检测、胶体金试纸条方法的敏感性比较

表3 临床血清样品检测结果符合率比较

3 讨论

GICA技术广泛应用于各个领域，显示出巨大的发展潜力和广阔的应用前景[5]。目前根据胶体金标记物的不同反应模式有3种：间接法、夹心法及竞争法。间接法胶体金试纸条主要用于抗体检测，夹心法胶体金试纸条主要用于大分子抗原的检测；竞争法多用于小分子抗原的检测。试纸条除了具有很好的敏感性和特异性之外，还具有操作简便、反应快速、无需其他特殊反应试剂等优点，检测结果易于判断，10 min左右即可进行判定。

本试验在克隆表达布鲁氏菌OMP25蛋白的基础上，建立了布鲁氏菌抗体间接胶体金检测方法。临床应用表明，本试验所制备的试纸条与进口的ELISA抗体检测试剂盒符合率为95.9%，敏感性为95.8%，特异性为97.0%。证明胶体金试纸条的检测结果是可靠的，可以代替ELISA、凝集反应与补体结合试验等方法用于布鲁氏菌抗体水平的检测，可作为羊布鲁氏菌的流行病学调查的工具。