2017—2018年河南省猪流行性腹泻病毒S基因序列分析

赵攀登 ， 陈 益 ， 朱文龙 ， 冀梦瑶 ， 卢建洲 ， 王 岩 ， 刘静静 ， 朱 芳 ， 田 欣 ， 赵圣杰

(1.河南牧业经济学院动物医药学院 ， 河南 郑州 450046 ； 2.河南省动物疫病预防控制中心 ， 河南 郑州 450000)

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种急性高度接触性肠道传染病，临床症状主要表现为呕吐、水样腹泻、脱水甚至死亡[1]。该病于1971年在英国首次暴发，随后蔓延至多个国家和地区，呈现地方流行性[2]。2010年10月，中国南方暴发PED，疫情迅速蔓延至全国，随后多个国家和地区均暴发PED，对全球的养猪业造成了巨大的经济损失[3]。PEDV属于I型冠状病毒，是有囊膜的单股正链RNA病毒。PEDV基因组全长约28 kb，基因组从5′到3′依次为5′UTR- replicase(1a/1b)-S-ORF3-E-M-N-3′UTR，其中S基因编码纤突蛋白(S蛋白)[4-5]。研究表明，S蛋白在中和抗体产生、介导病毒和细胞结合以及细胞膜融合方面发挥着重要作用[5-7]。S蛋白在PEDV遗传演化中有重要作用，S蛋白变异会引起PEDV毒力、宿主范围等发生变化[8-9]。

近年来，河南省不断暴发PED，导致大量仔猪死亡。因此，本试验采集了河南省8个规模化猪场仔猪腹泻样品，并对6个PEDV阳性样品进行S基因扩增、测序及遗传进化分析，进一步了解河南省PEDV的流行及遗传变异情况，为PED的防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料采集和处理 80份仔猪肠道样品于2017年10月—2018年2月采自河南省8个规模化猪场严重腹泻产房仔猪，保存于-80 ℃冰箱。

1.2 主要试剂 Agarose M、DL-2 000 DNA Marker、DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；HiScript II One Step RT-PCR Kit、Ultra GelRed(10 000×)，均购自Vazyme公司；TRIzol Plus，购自宝生物工程(大连)有限公司；乙醇、异丙醇、氯仿等试剂均为分析纯。

1.3 引物设计与合成 在PEDVS基因保守区域设计1对引物，用于检测PEDV。根据GenBank中CV777毒株设计扩增S基因引物，共设计4对相互重叠的引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列信息见表1。

表1 引物序列

1.4 病料处理、总RNA提取及RT-PCR检测 取肠道样品剪碎后加入10倍PBS，经匀浆后反复冻融3次，12 000 r/min离心5 min，取上清，按照 TRIzol Plus操作说明书提取总RNA，用适量的DEPC水溶解，-80 ℃保存备用。以RNA为模板，按照HiScript II One Step RT-PCR Kit操作说明书，用PEDV-F/PEDV-R进行RT-PCR检测，分析河南省规模化猪场PEDV阳性率。

1.5S基因扩增及测序 以PEDV阳性样品的RNA为模板，按照HiScript II One Step RT-PCR Kit操作说明书进行S基因扩增，反应体系：2×One Step Mix 25 μL，One Step Enzyme Mix 2 μL，上下游引物各2 μL，RNA模板3 μL，加去离子水至50 μL。反应条件：50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s进行35个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并经纯化后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.6 序列分析 采用MEGA 6.0软件对获得的6个S基因全长序列和GenBank发布的30个S基因序列进行同源性分析，并构建系统遗传进化树。

2 结果

2.1 病料检测及PEDVS基因扩增 从8个规模化猪场80份样品中检测出6个猪场60份样品为PEDV阳性，阳性率为75%。选取6个规模化猪场的阳性病料，编号为1、2、3、5、6、7，从阳性病料中扩增S基因的4个片段，均获得大小分别为1 358 bp、1 380 bp、1 321 bp和712 bp的片段，与预期结果相符(图1)。经测序和NCBI比对，获得全长S基因，分别命名为1-S、2-S、3-S、5-S、6-S、7-S。

2.2 PEDVS基因序列分析 6株PEDVS基因核苷酸及推导的氨基酸同源性对比显示，同源性分别是98.4%～99.9%和98.2%～100%，其中2-S和3-S之间氨基酸同源性最高，为100%，3-S和5-S之间氨基酸同源性最低，为98.2%。6株PEDVS基因与经典毒株CV777之间的核苷酸及氨基酸同源性分别是93.7%～94.9%和92.4%～94.6%，在第59～62位有4个氨基酸(QGVN)插入，第140位有1个氨基酸插入(N)，在第160位有1个氨基酸缺失(G)，与其他PEDV参考毒株之间的核苷酸及氨基酸同源性分别是94.8%～98.9%和94.1%～99.2%，其中6-S与2002年韩国毒株Spk1之间氨基酸同源性最低，为94.1%，5-S与2015年中国毒株CH-CLC-01-2015(KR296682)之间氨基酸同源性最高，为99.2%。

2.3 PEDVS基因遗传进化分析 将6株PEDVS基因与PEDV参考株构建系统进化树(见图2)，结果显示，本试验获得的6株PEDVS基因位于同一分支上，其中1-S、3-S、6-S和7-S亲缘关系最近，并且与2015年中国毒株CH-CLC-01-2015(KR296683.1)亲缘关系较近；2-S与2016年中国毒株GZMR(KX073610.1)、YZ2(KU237234.1)和2016年韩国毒株J3142(KP995064.1)亲缘关系较近；5-S与2016年中国毒株CH-HNAY-14.7(KT989366.1)和CH-SCYA-2-201(KU97542.1)亲缘关系最近。6株PEDVS基因与经典毒株CV777(JN599150.1)均处于不同的分支上。

图1 S基因4个片段RT-PCR扩增结果

3 讨论

猪流行性腹泻能够引起不同阶段的猪出现腹泻、脱水等症状，尤其对产房10日龄内的仔猪可引起较高的死亡率，严重危害世界养猪业，近年来猪流行性腹泻发病依然频繁[10-11]。卢冰霞等采集了广西14个地区331个腹泻样品，PEDV检测率为63.44%[12]。王二鑫等对河南省不同地区67份腹泻样品进行检测，PEDV阳性率为64.2%[13]。赵丽等对河南省200份临床腹泻样品进行检测，PEDV阳性率为71.5%[14]。本试验对发生新生仔猪腹泻的8个规模化猪场进行采样，共收集80份样品，其中6个规模化猪场60份样品均检测出PEDV，说明PED的发病率较高，流行情况严重。经调查，发生PED的6个规模化猪场均免疫过商品化猪流行性腹泻疫苗，由此说明疫苗免疫或者母源抗体不足以保护仔猪抵抗PEDV流行毒株的感染。

S基因是PEDV重要的抗原基因，通过对PEDVS基因测序，可了解PEDV流行毒株的变化趋势。

本试验通过对河南省6个规模化猪场PEDVS基因全长进行扩增和测序，并进行序列同源性分析发现，6株S基因核苷酸和氨基酸之间同源性较高，可能源自同一毒株。但是6株S基因和经典毒株CV777同源性较差，并存在氨基酸的插入和缺失，即在第59～62位存在4个氨基酸(QGVN)插入，在第140位和第160位分别插入1个氨基酸(N)和缺失1个氨基酸(G)，与之前的研究报道相似。遗传进化分析表明，6株S基因属于同一分支，与2015年中国流行毒株、2016年中国毒株和韩国毒株亲缘关系较近。但6株S基因与经典毒株CV777(JN599150.1)、83P-5(AB548618)、DR13(DQ862099)等位于不同分支，亲缘关系较远。

本试验明确了河南省PEDV的流行和遗传变异情况，揭示了PEDV流行毒株与经典毒株存在较大差异，可能是免疫失败和PED发病的主要原因。本试验为PED的监测及防控提供了参考依据。