花青素协同奥沙利铂对人结肠癌HCT116细胞增殖及凋亡的影响

颜彦，吴琳，林道锐

结肠癌是一种常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率都较高，近年来随着我国高脂肪低纤维饮食结构的变化，结肠癌成为了消化道最常见的恶性肿瘤之一[1-2]。由于结肠癌位置低，其位置深入盆腔，解剖关系复杂，传统的手术治疗往往无法将肿瘤彻底清除，因此患者术后复发率高[3]。放化疗法虽然对患者有不错的治疗效果，但其毒副作用明显，不仅严重影响患者的生活质量，同时有些患者因承受不了化疗的痛苦而选择终止治疗，对患者的康复十分不利[4-5]。目前常用的肿瘤化疗辅助药物有奥沙利铂(oxaliplatin，L-OHP)，使用L-OHP可以有效抑制肿瘤细胞的增殖并促进肿瘤细胞的凋亡[6-7]，但大量使用L-OHP有一定的副作用，因此寻求对结肠癌新的治疗药物是目前研究的重点。花青素又称花色素，是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素[8]。研究表明花青素主要是通过清除自由基抗氧化作用，抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡[9-10]。但目前关于花青素协同奥沙利铂对结肠癌细胞的增殖和凋亡作用效果的研究较少。本文旨在研究花青素协同奥沙利铂对人结肠癌HCT116细胞增殖及凋亡的影响，以期了解花青素协同奥沙利铂对人结肠癌HCT116细胞增殖及凋亡的机制。

1 材料与方法

1.1 主要细胞

人结肠癌HCT116细胞购自中国科学院细胞库。

1.2 主要试剂与仪器

花青素(纯度>98)购自天津科密欧有限公司；奥沙利铂(国药准字：H20000337；规格：50 mg)江苏恒瑞药业股份有限公司；青霉素钠购自哈药集团制药总厂；RPMI1640 培养基购自广州威佳科技有限公司；青霉素钠购自哈药集团制药总厂；A Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(货号：BB-4101；批号：BB-4101)购自BestBio-贝博公司；磷酸缓冲液PBS购自天津科密欧有限公司；Smad2抗体(货号：sc-101153；批号：20190103)、Smad3抗体(货号：sc-133098；批号：20190105)、Bcl-2抗体(货号：sc-7382；批号：20181201)、Bax抗体(货号：sc-7480；批号)、Ki67抗体(货号：sc-23900；批号:20181203)购自美国Santa Cruz公司。

TGL-16M低温离心机购自济南来宝医疗器械有限公司；光学显微镜购自东莞市同创仪器有限公司；酶联免疫检测仪购自北京诺亚威仪器仪表有限公司；荧光分光光度计购自上海仪电分析仪器有限公司；流式细胞仪购自赛默飞世尔科技有限公司；细胞培养箱购自美国Forma公司；蛋白电泳及转膜仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 分组干预 体外培养人结肠癌HCT116细胞，并分为：对照组、花青素组、奥沙利铂组、联合组。对照组细胞使用无血清培养基培养；花青素组使用无血清培养加含有100 g/L的花青素培养；奥沙利铂组使用无血清培养加含有0.010 g/L的奥沙利铂培养；联合组使用无血清培养加含有100 g/L的花青素及0.010 g/L的奥沙利铂培养。

1.3.2 细胞培养 将人结肠癌HCT116细胞培养于含10%FBS、100 U/mL 青霉素和100 U/mL链霉素RPMI1640 培养基中，保存在温度为37 ℃、CO2浓度为5%的培养箱内培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.3.3 MTT法检测细胞的增殖情况 将对数生长期的人结肠癌HCT116细胞接种于孔板中分别用含花青素(30 g/L、60 g/L、90 g/L、120 g/L、150 g/L)、奥沙利铂(0.003 g/L、0.006 g/L、0.009 g/L、0.012 g/L、0.015 g/L)、联合用药(花青素30 g/L+奥沙利铂0.003 g/L、花青素60 g/L+奥沙利铂0.006 g/L花青素90 g/L+奥沙利铂0.009 g/L花青素120 g/L+奥沙利铂0.012 g/L花青素150 g/L+奥沙利铂0.015 g/L)培养液预处理1 d。在接种的孔板中加入MTT溶液。4 h后去除上清，加入DMSO震荡至结晶物完全溶解后溶解。分别48 h时波长为570 nm处溶解的溶剂的检测光密度(OD)值。

1.3.4 克隆形成实验检测细胞生长 取对数生长期人结肠癌HCT116细胞，制作1×103个/mL单细胞悬液，六孔板中加入2.6 mL的细胞培养液，置于培养箱中平衡后，每孔加入0.4 mL的细胞悬液(约400个细胞)，2周后微镜下可见明显克隆形成，结晶紫染色后拍照，并计算克隆形成率。

1.3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 取对数生长期人结肠癌HCT116细胞，使用恒温离心机保持4 ℃，离心5 min收集细胞；收集细胞后加入100 μL Binding Buffer重悬细胞并加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，轻轻混匀；室温避光孵育15 min并加入400 μL Binding Buffer使用流式细胞仪检测期人结肠癌HCT116细胞凋亡情况。

1.3.6 Western blot 检测蛋白表达水平 将人结肠癌HCT116细胞1×105个/孔板接种至6孔板，每个浓度设置5个重复孔，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测各孔蛋白总量。将样本经10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在100 V条件下分离，按照凝胶面积0.65 mA/cm2的恒定电流转移1.5 h至PVDF膜后使用5%的脱脂奶粉恒温封闭2 h，加入稀释比例为1∶500的兔抗人Ki 67、Bcl-2、Bax、TGF、p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3抗体，在4 ℃条件下孵育过夜，TBST漂洗后加入二抗孵育1.5 h；曝光后以β-actin为内参蛋白，目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值为相对蛋白表达水平，实验重复3次。

1.4 统计学方法

本研究数据处理采用软件为SPSS 22.0，作图采用软件为GraphPad Prism5，多组间比较使用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法；若P<0.05则表明数据差异有统计学意义，本研究所有检验均为双侧检验。

2 结果

2.1 花青素协同奥沙利铂对人结肠癌HCT116细胞生长的影响

由MTT实验可以发现，48 h奥沙利铂处理人结肠癌HCT116细胞半数致死浓度(IC50)为0.010 g/L，花青素对人结肠癌HCT116细胞IC50为100 g/L，花青素联合奥沙利铂对人结肠癌HCT116细胞IC50为：花青素60 g/L、奥沙利铂0.006 g/L，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。

图1 花青素协同奥沙利铂对人结肠癌HCT116细胞生长的影响

2.2 花青素协同奥沙利铂对人结肠癌HCT116细胞增殖的影响

由克隆形成实验和蛋白质实验可以发现，相比对照组，花青素组和奥沙利铂组细胞克隆形成率、Ki67蛋白表达水平显著降低(P<0.001)；相比花青素组和奥沙利铂组，联合组细胞克隆形成率、Ki67蛋白表达水平显著降低(P<0.001)，见图2。

图2 花青素协同奥沙利铂对人结肠癌HCT116细胞增殖的影响 A:克隆形成实验结果；B:增殖蛋白Ki67检测结果；与对照组相比,**P<0.01；与花青素组或奥沙利铂组相比,##P<0.01

2.3 花青素协同奥沙利铂对人结肠癌HCT116细胞凋亡的影响

由流式细胞仪检测人结肠癌HCT116细胞凋亡和蛋白质印迹实验发现，相比对照组，花青素组和奥沙利铂组人结肠癌HCT116细胞凋亡率、Bax蛋白性对表达显著升高，Bcl-2蛋白相对表达显著降低(P<0.01)；相比花青素组和奥沙利铂组，联合组细胞人结肠癌HCT116细胞凋亡率、Bax蛋白性对表达显著升高，Bcl-2蛋白相对表达显著降低(P<0.01)，见图3。

2.4 花青素协同奥沙利铂对人结肠癌HCT116细胞TGF-βsmad信号通路的影响

由蛋白质印迹实验可以发现，相比对照组，花青素组和奥沙利铂组p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3、TGF蛋白相对表达水平显著升高(P<0.01)；相比花青素组和奥沙利铂组，联合组p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3、TGF蛋白相对表达水平显著升高(P<0.01)，见图4。

3 讨论

目前结肠癌患者多使用放化疗的治疗方案，但化疗和放疗均会给患者带来较多的痛苦及不良反应，寻找合适的辅助药物减少患者的痛苦具有重要的临床意义。现阶段研究相关的药物主要可以通过抑制结肠癌的恶性增殖、侵袭及迁移等相关恶性生物学特征起到辅助治疗的效果。奥沙利铂和花青就是两种较为常见的辅助药物，对部分癌细胞具有一定的抑制作用，本研究检测了青素协同奥沙利铂对人结肠癌HCT116细胞增殖及凋亡的影响。使用奥沙利铂处理人结肠癌HCT116细胞，48 h后，半数致死浓度为0.010 g/L；使用花青素处理人结肠癌HCT116细胞，48 h后，半数致死浓度为100 g/L；故本实验花青素组和分别选用100 g/L，奥沙利铂组0.010 g/L联合组使用花青素组和分别选用100 g/L+奥沙利铂组0.010 g/L进行后续实验。

细胞有丝分裂是其增殖基础，其中Ki67是一种核抗原[11]，Ki67是一种细胞核内与细胞分裂增殖相关的蛋白抗原，其表达水平反映细胞增殖的敏感指标同时这种基因在维持结构方面起着重要作[12]。同时Ki67对维持DNA结构稳定及细胞有丝分裂过程中发挥重要作用，其表达程度与肿瘤细胞的增殖活性密切相关，表达水平越高肿瘤细胞增殖能力越强[13]。本研究发现，相比对照组，花青素组和奥沙利铂组细胞克隆形成率、Ki67蛋白表达水平显著降低，相比花青素组和奥沙利铂组，联合组细胞克隆形成率、Ki67蛋白表达水平显著降低。说明使用花青素和奥沙利铂均可以有效抑制人结肠癌HCT116细胞的增殖，且联合用药效果显著优于单一使用药物。这可能是因为两者联合使用可以有效抑制增殖相关蛋白的表达，实现抑制结肠癌细胞的增殖。熊非等[14]研究表明,奥沙利铂可以有效抑制增殖相关蛋白Ki67的表达实现抑制结肠癌细胞的增殖，与本研究得出的结论相一致。

图3 花青素协同奥沙利铂对人结肠癌HCT116细胞凋亡的影响 A:流式细胞仪检测结肠癌细胞凋亡情况；B:凋亡相关蛋白表达情况；与对照组相比,**P<0.01；与花青素组或奥沙利铂组相比,##P<0.01

图4 花青素协同奥沙利铂对人结肠癌HCT116细胞TGF-βsmad信号通路的影响 与对照组相比,**P<0.01；与花青素组或奥沙利铂组相比,##P<0.01

激活细胞的凋亡途径是抑制肿瘤细胞增殖的有效途径之一，细胞凋亡指细胞为维持内环境稳定，由基因控制的有序死亡过程，而肿瘤的发生发展过程往往伴随有细胞凋亡抑制的情况[15]。Bcl-2家族也是一种常见的凋亡控制基因，其中主要的基因包括Bcl-2和Bax，Bcl-2是抑凋亡基因，Bax是促凋亡基因[16]。本研究发现，相比花青素组和奥沙利铂组，联合组细胞人结肠癌HCT116细胞凋亡率、Bax蛋白性对表达显著升高，Bcl-2蛋白相对表达显著降低。说明使用花青素组和奥沙利铂可以显著促进人结肠癌HCT116细胞的凋亡，且两种药物联合使用效果更好。张莹等[17]研究表明,奥沙利铂可以有效提高结肠癌细胞相关凋亡基因Bax的表达，抑制抑凋亡基因Bcl-2的表达，促进其凋亡与本研究得出的结论相一致。

Smads家族蛋白是一种可以参与TGF-β家族在细胞内信号传导的一种蛋白质[18]。这种蛋白为受体激活型蛋白，当Smads2/3与TGF-β的Ⅰ型受体结合形成受体复合物，会在磷酸化后从受体复合物上释放出来，与胞浆内的smad4结合形成低聚体复合物，转移到细胞核内激活相应启动子的活性介导细胞的凋亡[14]。本研究发现，相比对照组和单一用药的两组，联合组p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3、TGF蛋白相对表达水平显著升高[19]。说明使用花青素组和奥沙利铂可以促进TGF-β/Smad信号通路，且两种药物联合使用效果更好。李素云等[20]研究表明，通过调控结肠癌细胞TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达可以有效抑制结肠癌细胞的恶性生物学特征，与本研究得出的结论相一致。

综上所述花青素协同奥沙利铂可以促进人结肠癌HCT116细胞的凋亡并抑制其增殖，且作用效果显著优于使用单一药物，其作用机制可能是通过调节TGF-β/Smad信号通路实现，但本研究涉及到联合用药的浓度梯度较少，在后续的实验中将进一步增加不同的浓度梯度进行实验。