基于网络药理学方法探索达原饮治疗发热作用机制

2020-05-16刘邵阳白辰徐竞男黄羚高飞骆长永姜欣于河谷晓红刘铁钢

中国中医药信息杂志 2020年5期

刘邵阳，白辰，徐竞男，黄羚，高飞，骆长永，姜欣，于河，谷晓红，刘铁钢

刘邵阳，白辰，徐竞男，黄羚，高飞，骆长永，姜欣，于河，谷晓红，刘铁钢

北京中医药大学，北京 100029

运用网络药理学方法对达原饮进行分析，探索达原饮治疗发热的相关靶点与通路，明确其作用机制与潜在治疗疾病，为后续研究提供指导。通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索达原饮各组成药物的主要化学成分及作用靶点，参考类药五原则并结合口服生物利用度对成分靶点数据进行筛选，通过String数据库检索筛选后的靶点，得到达原饮作用靶点基因，在CTD数据库中检索发热（fever）相关作用靶点基因，对二者进行比较分析，取重复值，得到达原饮治疗发热相关靶点；在String数据库中检索达原饮治疗发热相关靶点，得到达原饮治疗发热相关通路；利用Cytoscape3.7.0软件对通路进行模块化分析，选择分值最高者，在WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit中进行可视化分析。得到达原饮治疗发热相关靶点432个，相关通路75条，其中特异性疾病相关通路21条，非特异性疾病相关通路54条。达原饮治疗发热的作用机制涉及以代谢为中心的多种途径，可能通过多靶点复杂通路的共同干预起效。本研究就达原饮对于癌性发热的治疗补充了数据支持，并推测达原饮治疗神经退行性疾病具有可能性。

达原饮；发热；网络药理学

达原饮出自明代吴又可《温疫论》，由“槟榔（二钱），厚朴（一钱），草果仁（五分），知母（一钱），芍药（一钱），黄芩（一钱），甘草（五分）”组成，主治“温疫初起，先憎寒而后发热，日后但热而无憎寒也。初得之二三日，其脉不浮不沉而数，昼夜发热，日晡益甚，头疼身痛”[1]，具有开达膜原、辟秽化浊功效。临床研究表明，达原饮治疗发热性疾病疗效优于抗菌、抗病毒药，可用于多种类型发热的治疗，如感染性发热、湿热型发热、持续性发热、高热、傍晚后发热、间断发热、低热等，特别是对感染性发热和湿热型发热具有更重要的作用[2]。实验研究显示，达原饮具有显著的解热作用，且能平稳降温，无高低起伏之弊，其作用机制可能是通过降低脑脊液的前列腺素E2含量，从而减少对体温中枢的兴奋性刺激，或与降低血清白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α水平及肝组织髓过氧化物酶活性有关[3-4]。

达原饮治疗发热疗效确切，但其作用机制尚缺乏系统全面研究。网络药理学基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络，系统综合地观察药物对疾病网络的干预与影响，从而揭示药物协同作用于人体的机理[5]。本研究运用网络药理学方法建立达原饮治疗发热的相关靶点数据库，构建靶点基因与通路的网络关系，进而分析相关病理通路，总结归纳达原饮治疗发热的相关作用机制，并探讨其潜在治疗疾病。

1 资料与方法

1.1 达原饮作用靶点确定

登录中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），在“HERB”项中分别查询达原饮各组成药物（槟榔、厚朴、草果、知母、芍药、黄芩、甘草），得到药物的主要化学成分，构建达原饮化学成分数据库；检索达原饮各化学成分对应的作用靶点，构建达原饮作用靶点数据库；将上述2个数据库的内容进行合并处理，得到以中药、成分、靶点为主要内容的达原饮成分-靶点初步数据。参考类药五原则，并结合口服生物利用度（OB），对达原饮成分靶点数据进行筛选。设置筛选参数为：分子量（MW）＜500，氢键给体数目（Hdon）＜5，氢键受体数目（Hacc）＜10，OB＞30%。对筛选结果以靶点名称为基准删除重复值，得到达原饮相关靶点。登录蛋白质相互作用数据库String（http://string-db.org/），选择“multiple names”，输入上述达原饮相关靶点名称，选择物种为“homo sapiens”进行检索，在Exports一栏中得到达原饮作用靶点。

1.2 发热相关靶点确定

通过疾病基因数据库CTD（http://ctdbase.org/）检索疾病“fever”，得到发热相关靶点。

1.3 达原饮治疗发热相关靶点确定

将达原饮作用靶点与发热相关靶点进行比较分析，取二者交集，即为达原饮治疗发热相关靶点。

1.4 达原饮治疗发热相关靶点网络关系构建

在String数据库中录入达原饮治疗发热相关靶点，在“organism”中选择“homo sapiens”进行检索，获得蛋白相互作用关系等生物信息。将数据导入网络可视化工具Cytoscape3.7.0软件，获得分子相互作用关系，并进行模块化分析。

1.5 达原饮与发热相关通路富集分析

使用Cytoscape3.7.0软件进行模块化分析后，对得分较高的基因组进行整理，在注释及富集分析数据库DAVID中对达原饮治疗发热相关通路进行GO和KEGG富集分析，使用在线基因分析工具WebGestalt（WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit）进行生物进程和功能的可视化分析。

2 结果

2.1 达原饮治疗发热相关靶点

检索得到达原饮作用靶点436个，发热相关靶点26 168个，二者比较分析后取重复值，得到达原饮治疗发热相关靶点432个。

2.2 达原饮治疗发热靶点网络关系

在String数据库中获得6471条达原饮治疗发热相关靶点基因间作用关系，得到相应靶蛋白关系图。使用Cytoscape3.7.0软件进行模块化处理后获得16个基因模块。结果见图1、图2。

2.3 达原饮治疗发热靶点富集分析

对达原饮治疗发热靶点模块化处理结果中的模块1进行GO富集分析，获得生物进程、细胞成分、分子功能三方面内容，结果见图3。涉及生物进程共12类，按其所涉及基因数目从多到少依次为：代谢过程、生物调节、刺激反应、多细胞有机进程、发育进程、定位、细胞通讯、组织细胞组成、细胞增殖、多组织过程、繁殖、生长；涉及细胞成分共21类，按其所涉及基因数目从多到少依次为：细胞膜、细胞小泡、细胞液、细胞核、膜封闭腔、内膜系统、高分子复合物、线粒体、细胞外空间、内质网、细胞投影、膜、高尔基体、细胞骨架、染色体、内涵体、液泡、细胞外基质、微体、核糖体、脂质颗粒；涉及分子功能共17类，按其所涉及基因数目从多到少依次为：蛋白结合、离子结合、转移酶活性、水解酶活性、核苷酸结合、核酸结合、分子转导活性、脂质结合、转运活性、酶活性调控、染色质结合、抗氧化活性、电子载体活性、糖结合、氧结合、结构分子活性、分子适应活性。

图1 达原饮治疗发热相关靶蛋白关系图

图2 达原饮治疗发热靶蛋白模块分析结果

图3 达原饮治疗发热靶点模块1富集分析

2.4 达原饮治疗发热相关通路KEGG富集分析

经KEGG富集分析，共获得达原饮治疗发热相关通路75条，见图4。其中，特异性疾病相关通路21条，分别涉及前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、非小细胞性肺癌、膀胱癌、小细胞肺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、肾细胞癌、胶质瘤、黑色素瘤、慢性粒细胞白血病、急性髓细胞白血病等诸多癌症途径，阿尔茨海默病、亨廷顿病、朊粒病、肌萎缩侧索硬化症等神经系统疾病，以及幽门螺杆菌感染、同种异体移植排斥反应与2型糖尿病。本研究以“发热”为研究点，特异性疾病的通路较非特异性疾病通路更具有针对性，容易使结果分析产生偏倚，故对非特异性疾病通路进行深入分析。非特异性疾病相关通路共54条，见表1。可分为六类，其中代谢相关32条，免疫相关8条，内分泌相关5条，环境信息处理5条，细胞过程3条，神经系统相关1条。

图4 达原饮治疗发热相关KEGG通路

表1 达原饮治疗发热非特异性疾病相关通路

ID通路名称相关基因数 ID通路名称相关基因数 hsa04080Neuroactive ligand-receptor interaction28 hsa00620Pyruvate metabolism12 hsa00330Arginine and proline metabolism26 hsa00830Retinol metabolism12 hsa00980Metabolism of xenobiotics by cytochrome P45023 hsa00270Cysteine and methionine metabolism11 hsa00982Drug metabolism21 hsa04622RIG-I-like receptor signaling pathway11 hsa04920Adipocytokine signaling pathway19 hsa00500Starch and sucrose metabolism10 hsa04620Toll-like receptor signaling pathway19 hsa00140Steroid hormone biosynthesis10 hsa04722Neurotrophin signaling pathway19 hsa04662B cell receptor signaling pathway10 hsa00260Glycine, serine and threonine metabolism18 hsa00591Linoleic acid metabolism 9 hsa04910Insulin signaling pathway18 hsa04610Complement and coagulation cascades 9 hsa04020Calcium signaling pathway18 hsa00860Porphyrin and chlorophyll metabolism 8 hsa00590Arachidonic acid metabolism17 hsa00983Drug metabolism 8 hsa04370VEGF signaling pathway17 hsa00030Pentose phosphate pathway 7 hsa03320PPAR signaling pathway16 hsa00052Galactose metabolism 7 hsa04660T cell receptor signaling pathway16 hsa00340Histidine metabolism 7 hsa00350Tyrosine metabolism15 hsa00640Propanoate metabolism 7 hsa04115p53 signaling pathway15 hsa00071Fatty acid metabolism 7 hsa04912GnRH signaling pathway15 hsa04672Intestinal immune network for IgA production 7 hsa00480Glutathione metabolism14 hsa00360Phenylalanine metabolism 6 hsa04664Fc epsilon RI signaling pathway14 hsa00910Nitrogen metabolism 6 hsa04110Cell cycle14 hsa00410beta-Alanine metabolism 5 hsa00380Tryptophan metabolism13 hsa00450Selenoamino acid metabolism 5 hsa00010Glycolysis / Gluconeogenesis13 hsa00670One carbon pool by folate 4 hsa04621NOD-like receptor signaling pathway13 hsa04614Renin-angiotensin system 4 hsa04914Progesterone-mediated oocyte maturation13 hsa00053Ascorbate and aldarate metabolism 4 hsa04210Apoptosis13 hsa00400Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis 3 hsa04012ErbB signaling pathway13 hsa00680Methane metabolism 3 hsa00250Alanine, aspartate and glutamate metabolism12 hsa00460Cyanoamino acid metabolism 3

3 讨论

吴又可在达原饮方后阐释方义言：“槟榔能消能磨，除伏邪，为疏利之药，又除岭南瘴气；厚朴破戾气所结；草果辛烈气雄，除伏邪盘踞。三味协力，直达其巢穴，使邪气溃败，速离膜原，是以为达原也。热伤津液，加知母以滋阴；热伤营血，加白芍以和血；黄芩清燥热之余；甘草为和中之用。”[1]诸药合用，使邪热得清，津血得复，邪气溃败，速离膜原，具有开达膜原、辟秽化浊的功用。清代医家谢星焕《得心集医案》卷六痉厥门载有达原饮治疗小儿发热一案，辨为温疟，运用达原饮加减治疗，使热势得以控制[6]。

发热是指机体在致热原作用下或各种原因引起体温调节中枢功能障碍时，体温升高超出正常范围。外源性致热源如细菌内毒素，通过激活血液中的中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核吞噬细胞系统，使其产生并释放内源性致热源，如白细胞介素、肿瘤坏死因子和干扰素等，进而通过中枢介质引起发热。

达原饮治疗发热相关靶点共有432个，相关作用通路共75条。其中特异性疾病相关通路21条，非特异性疾病相关通路54条。由GO富集与KEGG富集结果可知，达原饮治疗发热所参与的生物进程重点集中于代谢过程。54条非特异疾病相关通路中，代谢相关通路32条，涉及药物、外源物质、多种氨基酸、糖、脂质、辅助因子和维生素、能量、淀粉与蔗糖、氮等多种物质的代谢途径，其他通路分别涉及免疫、内分泌、环境信息处理、细胞过程及神经系统。

21条特异性疾病相关通路中，癌症通路（hsa05200：Pathways in cancer）相关基因数量明显高于其他通路，且特异性疾病中包含前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、非小细胞性肺癌、膀胱癌、小细胞肺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、肾细胞癌、胶质瘤、黑色素瘤、慢性粒细胞白血病、急性髓细胞白血病共13种癌症。临床观察表明运用达原饮加减能有效治疗癌性发热。如申建中[7]采用达原饮加减治疗癌性发热42例，与西药治疗40例比较，疗效较优且无不良反应。张伟[8]采用达原饮加减治疗湿热蕴结型癌性发热亦取得较好临床效果，且作用缓和、平稳、不良反应小，耐受性好。本研究采用网络药理学方法验证了达原饮对于癌性发热的治疗作用，推测达原饮在治疗癌性发热方面具有作用倾向性，因而会产生较好的治疗效果，提示临床可进一步深入研究达原饮对于癌性发热的治疗应用。

非特异性疾病相关通路中涉及1条神经系统信号通路hsa04722：Neurotrophin signaling pathway（神经营养素信号通路）。神经营养素是参与神经细胞分化和存活的营养因子，神经营养素家族由神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养素3、神经营养素4组成，对神经发育和额外的高阶活动如学习和记忆起着重要的作用。特异性疾病中涉及阿尔茨海默病、亨廷顿病等神经系统退行性疾病。由此推测，达原饮对于神经退行性疾病可能存在治疗作用，可进一步发掘研究。

综上所述，达原饮治疗发热的作用机制涉及以代谢为中心的多种途径，可能通过多靶点复杂通路的共同干预起效。本研究就达原饮对癌性发热的治疗作用补充了数据支持，并推测达原饮治疗神经退行性疾病具有可能性。由于中药化学成分的复杂性，本研究仅从数据角度进行阐释，仍存在很多不足，后期可继续完善液相质谱、代谢组学等检测，通过实验研究进一步探索与验证。

[1] 吴有性.温疫论[M].张志斌,整理.北京：人民卫生出版社,2007：4-5.

[2] 李昌勤,刘瑜新,康文艺.达原饮的临床应用概述[J].中成药,2010, 32(3)：470-473.

[3] 任慧玲,严彪,梁之桃,等.达原饮解热作用研究及UPLC-Q-TOF/MS分析[J].中成药,2015,37(1)：131-137.

[4] 安潇.新方达原饮抗病毒性发热的实验研究[D].济南：山东中医药大学,2002.

[5] 张彦琼,李梢.网络药理学与中医药现代研究的若干进展[J].中国药理学与毒理学杂志,2015,29(6)：883-892.

[6] 谢星焕.得心集医案[M].任娟莉,校注.北京：中国中医药出版社,2016：201-208.

[7] 申建中.达原饮加减治疗癌性发热42例临床观察[J].江苏中医药, 2010,42(4)：36.

[8] 张伟.达原饮加减治疗湿热型癌性发热的临床疗效观察[D].济南：山东中医药大学,2014.

Study on Mechanism ofDecoction in Treating Fever Based on Network Pharmacology

LIU Shaoyang, BAI Chen, XU Jingnan, HUANG Ling, GAO Fei, LUO Changyong, JIANG Xin, YU He, GU Xiaohong, LIU Tiegang

To explore the related targets and mechanism ofDecoction in treating fever by analyzing the prescription with the method of network pharmacology; To clarify the potential therapeutic diseases ofDecoction; To provide guidance for the follow-up study.The main chemical components and action targets of the constituent medicine ofDecoction were retrieved through TCMSP. Component target data were screened based on the five principles of similar medicines and oral bioavailability. The screened targets were retrieved through String database to obtain the target genes ofDecoction. The disease (fever) was searched in the CTD to obtain the relevant target genes. The two were compared and analyzed, and the repeated values were taken to obtain the target related to the treatment of fever byDecoction. The fever-related targets treated byDecoction were retrieved in String, and fever-related pathway ofDecoction was obtained; Cytoscape 3.7.0 was used to perform a modular analysis of these pathways, the one with the highest score was selected, and a visual analysis was performed in the WEB-based GEne SeT AnaLysis Toolkit.Totally 432 related targets and 75 related pathways ofDecoction in treating fever were obtained, among which 21 were specific disease-related pathways and 54 were non-specific disease-related pathways.The mechanism ofDecoction in treating fever involves multiple pathways centered on metabolism and the treatment is possibly achieved through joint intervention with multiple targets and complex pathways. This article supplemented the data support forDecoction for the treatment of cancerous fever, and speculated thatDecoction has the possibility of treating neurodegenerative diseases.

Decoction; fever; network pharmacology