ADAMTS4与ADAMTS5蛋白酶在胶质瘤中表达的相关性

孙晓玲 张晓娟 张清泉 邱雷 王林娜 侯素平

脑胶质瘤是临床常见的恶性肿瘤，其新增病例数约为1.4万例/年，该病可见于不同年龄人群中，不同类型胶质瘤的高发人群存在差异，男性发病率高于女性。脑胶质瘤患者的预后不佳，死亡率非常高，5年死亡率居于各类恶性肿瘤的第三位。胶质细胞存在细胞迁移性，而且脑胶质瘤细胞具有较高的侵袭能力，其病情进展为多种分子参与的复杂生物学过程，Kim等[1]的研究建立了动物胶质瘤模型，指出细胞外基质在胶质瘤细胞迁移中的作用。研究发现，细胞外基质的重塑已成为恶性肿瘤进展的关键因素，透明蛋白聚糖、含血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs，ADAMTS)之间平衡的改变可能参与病情变化。ADAMTS4、ADAMTS5 蛋白酶属于ADAMTS家族成员，两者均可诱导细胞外基质的分解、软化。但是，目前关于ADAMTS4、ADAMTS5 两种蛋白酶在恶性肿瘤发生、进展中的作用机制尚未明确，不同恶性肿瘤细胞中其表达水平存在差异，Chen等[2]研究发现，ADAMTS4在晚期结直肠癌中可以促进肿瘤的生长，而Lu等[3]发现ADAMTS4和ADAMTS5 的表达水平在结直肠癌早期阶段却降低。另有研究显示，在胃癌中细胞恶性程度越高则ADAMTS5表达水平越低[4]，而在非小细胞肺癌中ADAMTS5表达水平越高者5年生存率越低、预后越差[5]。因此，本研究分析ADAMTS4、ADAMTS5两种蛋白酶在胶质瘤中表达及其同患者病情、预后的相关性，以期为今后深入探讨ADAMTS4、ADAMTS5参与胶质瘤迁移的机制，寻求新的治疗靶点奠定基础。

1 对象和方法

1.1 观察对象选取作者医院神经外科自2016年1月至2017年1月期间收治的116例脑胶质瘤患者，男62例、女54例，年龄29～72岁，平均(54.68±9.32)岁。胶质瘤患者入组标准：(1)依据《WHO 2016年中枢神经系统肿瘤诊断及分类》[6]符合胶质瘤的诊断标准；(2)均为初诊患者；(3)对本研究知情同意；并排除合并其他恶性肿瘤、关节炎、血液系统疾病者，排除存在颅脑外伤以及脑部其他疾病者，排除在取样前接受放化疗等治疗者。

依据《WHO中枢神经系统肿瘤分类》[7]对胶质瘤进行组织学分级：Ⅰ级10例，Ⅱ级44例，Ⅲ级22例，Ⅳ级40例，Ⅰ、Ⅱ级为低级别胶质瘤，Ⅲ、Ⅳ为高级别胶质瘤，低级别胶质瘤生物学行为比较温和，有进展为高级别胶质瘤的趋势，高级别胶质瘤恶性程度高预后差，两者在治疗上也不同，区别胶质瘤的级别对患者的治疗和预后都很有意义，本实验就两组进行分析和讨论。依据《WHO中枢神经系统肿瘤分类》[7]进行病理分类：毛细胞星形细胞瘤10例，弥漫性星形细胞瘤20例，少突胶质细胞瘤10例，多形性黄色星形细胞瘤6例，少突星形胶质细胞瘤8例，间变性星形细胞瘤14例，间变性少突胶质细胞瘤8例，胶质母细胞瘤36例，弥漫性中线胶质瘤4例；伴重度瘤周水肿者42例，轻度瘤周水肿者74例；伴囊变者38例，未伴囊变者78例。

1.2 试剂和仪器兔抗人多克隆抗体 ADAMTS4、兔抗人多克隆抗体 ADAMTS5均来源于Santa Cruz Biotechnology公司，DAB显色试剂盒、免疫组化试剂盒、稀释液均来源于北京中杉生物技术公司，苏木素及伊红来源于上海碧云天技术有限公司。仪器包含石蜡切片机(Leica RM2245)、光学显微镜(奥林巴斯 BX43)、恒温水浴锅( HWS-12，上海合恒仪器设备有限公司)等。

1.3 方法

1.3.1免疫组化染色法和结果评价：收集患者经手术切除或穿刺采集的胶质瘤病灶组织，进行免疫组织化学检测，并取瘤周正常组织作为对照，取样范围为病灶区边缘3～5 cm，癌周正常组织定义依据为不含肿瘤细胞，由两名高年资病理医师在显微镜下进行双盲评判，有异议者舍弃。具体操作如下，病灶组织用组织脱水机脱水、透明后进行石蜡包埋制备成石蜡标本并连续切片切成4 μm厚的蜡片，选取质量好的一张，展片后平铺于处理后的载玻片上，玻片在55℃条件下烤干，使用二甲苯浸泡脱蜡、梯度酒精水化，再置于高压锅中用柠檬酸盐缓冲液浸泡进行抗原修复，用磷酸缓冲液冲洗5 min×3次，组织上滴加浓度为3% 的过氧化氢在37℃下8 min，冲洗5 min×3次。按照试剂盒说明书要求滴加一抗(兔抗人多克隆抗体 ADAMTS4、兔抗人多克隆抗体 ADAMTS5)、二抗(通用型鼠抗兔多克隆抗体)、DAB显色，去除多余的显色液，并浸入苏木素溶液5 min，自来水冲洗、梯度酒精脱水、二甲苯透明，最后用中性树胶封片。

在高倍(400倍)光学显微镜下观察病灶中全部细胞的染色状况，(1)按照染色强度计分，深棕黄色计为3 分，棕黄色计为2分，浅棕黄色计为1分，没有染色计为0分；(2)按照阳性着色细胞的百分比计分，随机选取10个高倍镜视野，计数阳性细胞百分比的平均数，百分比0%计为 0 分，1%≤百分比<25%计为1分，25%≤百分比<50%计为2分，50%≤百分比<75%计为3分，≥75%计为4分。按照两种计分结果的乘积评价蛋白酶的最终表达结果，<3.5分为阴性表达，≥3.5分为阳性表达。同样方法观察瘤周正常脑组织两种抗原的表达作为对照组。

染色结果由两名高年资主治医师分别观察，若观察结果存在分歧则由主任医师判定。

比较不同肿瘤分级、瘤周水肿程度以及是否伴囊变患者的病灶组织中ADAMTS4与ADAMTS5蛋白酶的阳性表达率差异(每组病例中ADAMTS4与ADAMTS5蛋白酶表达阳性的例数除以每组的总例数，得出的百分比即为表达率)，并分析两种蛋白酶表达率的相关性，比较ADAMTS4阳性、阴性表达与ADAMTS5阳性、阴性表达的累积生存率差异。瘤周水肿程度按照Schoenegger等[8]文献中的标准判断，>20 mm属于重度，≤20 mm属于轻度。所有入组患者术前均进行MRI检查，MRI征象能对不同级别的胶质瘤的囊性变进行准确反映[9]，MRI显示肿瘤实质部分T1W1为低或等信号，T2W1为高信号。囊性变在T1W1为低或等信号，T2W1为高信号，囊变的判断由两名影像科医生进行独立观察，意见一致视为囊变，有分歧者，由主任医生进行定夺。肿瘤囊变的部位、大小、多少及囊壁的厚薄均不作为单独因素加以区分。

1.3.2患者累积生存率计算：定期随访截止至2019年3月，随访时间为3～38个月。通过电话随访、病历信息收集等途径获取患者生存时间的资料。累积生存率即这段时间内仍存活例数/观察总例数。

1.4 统计学处理使用SPSS24.0软件进行分析。蛋白酶的表达率以n(%)的形式表示，不同方式分组中两组间蛋白酶表达比较采用χ2检验；两种蛋白酶表达率的相关性分析采用Spearman 分析；累积生存曲线采用Kaplan-Meier法进行绘制。以P<0.05表示差异具统计学意义。

2 结果

注：ADAMTS：含血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶，表1～3同 图 1 患者病灶细胞中ADAMTS4(A)、ADAMTS5(B)表达(免疫组化×400)

2.1 患者胶质瘤病灶细胞中ADAMTS4、ADAMTS5的表达率和相关性病灶组织中肿瘤细胞存在核异型性，核增大，ADAMTS4、ADAMTS5多位于细胞质和细胞外基质内，多呈棕黄色(图1)。

ADAMTS4、ADAMTS5表达率分别为79.31%(92例)、84.48%(98例)，Ⅳ级、Ⅲ级患者病灶组织中ADAMTS4与ADAMTS5蛋白酶表达率明显高于Ⅰ级、Ⅱ级者(P<0.05)；伴重度瘤周水肿患者的病灶组织中ADAMTS4与ADAMTS5蛋白酶的表达率明显高于伴轻度瘤周水肿者(P<0.05)；伴囊变和未伴囊变者的病灶组织中ADAMTS4与ADAMTS5蛋白酶的表达率差异无统计学意义(P>0.05)，具体见表1～3。

表1 不同级别胶质瘤ADAMTS4和ADAMTS5表达率比较〔n(%)〕

表2 不同瘤周水肿程度ADAMTS4和ADAMTS5表达率比较〔n(%)〕

表3 是否伴囊变ADAMTS4和ADAMTS5表达率比较〔n(%)〕

两种蛋白酶的表达率成正相关(r=0.361，P=0.001)。

2.2 两种蛋白酶的表达同累积生存率的关系ADAMTS4、ADAMTS5阳性表达者的累积生存率比阴性表达者均明显降低(P<0.05)，ADAMTS4蛋白酶表达的生存分析log-rank值=23.98，P=0.00，ADAMTS5表达的生存分析log-rank值=8.60，P=0.00，具体见图2和图3。

图 2 ADAMTS4蛋白酶阳性与阴性表达的生存曲线图

图 3 ADAMTS5蛋白酶阳性与阴性表达的生存曲线图

3 讨论

脑胶质瘤为神经系统的高发性恶性肿瘤，肿瘤细胞可扩散至周边或远处的脑组织，常规手术治疗无法完全清除病灶组织。另外，脑胶质瘤患者的预后差异显著，同一分级和类型胶质瘤患者的生存时间也可能存在较大差异，因此分析特殊蛋白表达同预后的关系具有重要意义。ADAMTS家族的蛋白酶结构域存在高度保守性，家族成员较多，随着分子生物学和蛋白组学的发展，研究者逐渐发现该家族多个蛋白酶成员参与肿瘤发生、进展或抑癌作用有关。在本研究中，脑胶质瘤患者病灶组织中ADAMTS4、ADAMTS5表达率分别为79.31%、84.48%，两种蛋白酶的表达率均较高，同朱德位等[10]的研究结果接近。

本研究的结果中，Ⅳ级、Ⅲ级患者病灶组织中ADAMTS4与ADAMTS5蛋白酶的表达率高于Ⅰ级、Ⅱ级者(P<0.05)；伴重度瘤周水肿患者的病灶组织中ADAMTS4与ADAMTS5蛋白酶的表达率高于轻度瘤周水肿者(P<0.05)，提示胶质瘤的分级、瘤周水肿程度越高，则患者病灶细胞中ADAMTS4、ADAMTS5蛋白酶表达越高，ADAMTS4、ADAMTS5蛋白酶在一定程度上可反映肿瘤的浸润程度和恶性程度。胶质瘤病灶首先分离出侵袭细胞并在整合蛋白的作用下将其黏附于细胞外基质上，脑组织中细胞外基质的主要成分为透明质酸、蛋白聚糖，病灶细胞可合成较多的透明质酸酶、蛋白酶，催化细胞外基质的分解，其中ADAMTS4可催化透明质酸结合蛋白B/b的水解[11]，阻碍该结合蛋白对神经胶质细胞运动、迁移的抑制作用，以至于肿瘤细胞发生迁移；ADAMTS5可催化细胞外基质的分解，促进膜锚定内皮前体细胞的释放，使得病灶细胞通过血管腔、血管-薄壁组织交界处发生迁移运动，从而介导肿瘤细胞的生长和血管的新生，导致病情进展。瘤周水肿会降低病灶周边组织的紧密度，同时影响血氧供应，有助于病灶细胞的迁移、扩散，因此重度瘤周水肿者的肿瘤细胞更易于侵袭，恶性程度更高，Wang等[12]的研究也表明这一观点。囊变是很多胶质瘤伴发的改变，囊变是血浆蛋白质在血-脑屏障损伤时进入到脑组织中，经过长时间积累形成的，由于肿瘤代谢快，增殖活跃，肿瘤新生血管与供血、供氧之间失衡，导致肿瘤发生坏死、出血和囊性变，Chan等[13]研究证实肿瘤囊变与缺氧因子(HIF-1α、VEGF、CD34)有关，本实验伴囊变与未伴囊变组织中的ADAMTS4和ADAMTS5两种蛋白表达率无统计学差异(P>0.05)，推断其作用机制可能与这些因子无关，而与上述水肿有关因子可能有关，具体机制有待进一步研究。

Dwyer等[14]的试验研究指出，ADAMTS4与ADAMTS5蛋白酶能降解胶质瘤微环境中透明质酸结合蛋白B/b，降解后的碎片，能促进胶质瘤细胞的运动，尤其是在晚期胶质瘤中，能够促进肿瘤的转移。还有研究指出，胶质瘤周水肿程度越重、胶质瘤分级越高则组织中转化生长因子-β、白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等的表达水平越高，这些活性因子水平的变化将会影响ADAMTS4、ADAMTS5的表达，而且IL-1的刺激会促进ADAMTS4高表达[15]，推测其原因可能为这些细胞因子和ADAMTS4、ADAMTS5蛋白酶共同参与了胶质瘤的病情进展，但其相互关系及机制还不清楚。

经Spearman分析上述两种蛋白酶表达率成明显正相关(P<0.05)，提示两种蛋白酶可能存在协同效应，然而其具体作用信号通路尚不明确，仍然需进一步深入分析。

本研究还发现，ADAMTS4、ADAMTS5两种蛋白酶阳性表达者的累积生存率比阴性表达的明显降低(P<0.05)，这提示ADAMTS4、ADAMTS5的表达可能同胶质瘤患者的预后状况有关，而ADAMTS4、ADAMTS5的阳性表达者生存时间较短，可能与阳性表达者病情较重有关。

综上可见，脑胶质瘤分级高、瘤周水肿严重者ADAMTS4、ADAMTS5两种蛋白酶表达率增高，而是否伴囊变者这两种蛋白酶表达率无统计学差异，推测ADAMTS4、ADAMTS5与脑胶质瘤的病情进展和病灶浸润有关，同时这两种蛋白酶可能存在协同效应，但是这两种蛋白酶与脑胶质瘤的具体关系还需进一步研究进行验证。