表面活性剂单体引起的细胞膜失稳

王 平, 盛 洁, 雷一腾, 马贝贝，朱 涛，蒋中英,

(1. 伊犁师范大学电子与信息工程学院 微纳电传感技术与仿生器械重点实验室, 伊宁市 8350002. 南京大学物理学院 固体微结构物理国家重点实验室, 南京市210093)

1引 言

表面活性剂是一类能够显著降低物质表面张力的双亲分子. 与细胞膜作用, 可实现细胞裂解、脂质体外排与膜组分搜集等. 常用的单链表面活性剂的物理性质主要由其带电性、疏水链长度等决定[1, 2]. 需要选择表面活性剂以实现特定的功能, 如阳离子型的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)被用于提取负电性生物大分子[3], 吸附自促进的十二烷基硫酸钠(SDS)被用于搜集失活的膜蛋白[4], 对氢键作用影响较弱的Triton X-100被用于提取磷脂筏结构[5].

高于临界成胶束浓度(CMC), 表面活性剂可组装为胶束. 聚集状态的表面活性剂可将生物膜组分拔出原始的双层膜结构, 使后者的完整性严重受损[6]. 但低于CMC, 以单体状态存在的表面活性剂分子与生物膜的相互作用的机制与调控的认识仍存在很多不足.

Tamm等报道了表面活性剂单体可插入生物膜结构, 并考察了结合速率常数与疏水链长间的关联[7]. 插入生物膜的分子可以显著地改变了前者的侧向流动性、刚性、主转变温度等性质[8-10]. 但变化的方向与程度由磷脂膜与表面活性剂的组分共同决定[9]. 同时, 插入分子产生的膜内外叶非对称与过量膜面积是否会引起三维结构重组也是一个开放的问题. 在低浓度下, 月桂酸酯等表面活性剂插入产生了微管或出芽结构[11], 但多肽表面活性剂却未引起相应的膜三维形态重构[12].

探索单体状态的表面活性剂与生物膜作用是极其重要的课题. 即使在CMC以上, 仍存在以单体态存在的表面活性剂[2], 需要区分单体和胶束态对生物膜产生的差异. 在本文中, 我们采用了三种常用代表性表面活性剂与仿生磷脂膜作用, 分别是阴离子SDS、阳离子CTAB及非离子Triton X-100. 在CMC以下, 考查了它们的插入对膜形态、完整性的影响, 并进一步建立了与细胞毒性间的关联. 我们的研究在分子水平深化了磷脂与表面活性剂的作用方式、调控手段的理解.

2实验部分

2.1实验材料

二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)购于Avanti Polar Lipids. Hela 细胞株、DiI、DMEM 细胞培养液购于江苏凯基生物技术公司. 其它化学试剂购于国药集团化学试剂公司. 所有试剂均为分析纯.

2.2支撑膜与表面活性剂溶液的制备

磷脂支撑膜(SLBs)通过DOPC囊泡在二氧化硅或玻璃衬底自发融合制备, 囊泡通过挤出法在Tris-HCl缓冲液中制备, 详见我们之前的报道[13]. 表面活性剂以给定浓度(C)溶于Tris-HCl缓冲液(模型膜实验)或DMEM溶液(细胞实验)中, 在实验前超声并离心除气. 本研究的所有实验温度均控制在37 ℃, 数据平均值和标准方差均为三次以上实验的结果.

2.3临界成胶束浓度的检测

采用LS55荧光光谱仪(PerkinElmer)表征了1-芘甲醛荧光随表面活性剂浓度的变化(激发波长365nm, 发射波长400 - 600nm). 当荧光发射峰(λpeak)为473 nm时表面活性剂以单体形式存在, 发生峰蓝移则表示达到CMC[11].

2.4石英电子微天平及耗散系数表征(QCM-D)

QCM-D在E1(Qsense AB)上进行, 使用二氧化硅沉积的石英芯片. 通过共振频率(Δf)、耗散系数的偏移(ΔD)表征了芯片表面吸附层的质量与粘滞性变化. Δf与质量成正比, ΔD与耗散性成正比.

2.5荧光显微观测

在DOPC囊泡中掺杂1 mol% DiI荧光染料, 使用IX73荧光显微镜(Olympus, 100倍油镜)与控温灌流舱(Warner)对盖玻片衬底(Fisher)的SLBs、及其接触表面活性剂溶液后的荧光图像进行了表征.

2.6MTT实验

表面活性剂对Hela细胞的毒性通过MTT比色法进行了检测. Hela细胞在96孔板铺板后24小时, 加入给定浓度的表面活性剂DMEM溶液. 培养6 h后再加入MTT溶液, 孵化4 h后, 将底部沉淀溶于DMSO进行紫外吸收检测(Bio-Rad 680, 检测波长570 nm). 每个样品进行了五个重复实验.

3结果与讨论

首先, 基于疏水探针1-芘甲醛在水相与胶束中的荧光发射峰差异, 荧光光谱表征了三种表面活性剂的CMC. 如图1所示, 当CTAB在低浓度以单体存在时(CCTAB0.7 mM), 1-芘甲醛的λpeak为～ 473nm. 当CTAB浓度提高形成胶束后(CCTAB> 0.8 mM), λpeak逐渐蓝移. 由图1可得, CTAB、SDS与Triton-100的CMC分别为0.8, 5, 0.2mM. Triton X-100的CMC低于前两者, 与早先报道一致[14]. 因此本研究将C限制在180 μM以下, 确保表面活性剂均以单体形式存在.

随后, 通过QCM-D表征了三种表面活性剂与DOPC磷脂膜的相互作用. DOPC是生物膜中常见的双电性磷脂. 许多研究基于该磷脂, 考察了模型膜与双亲分子相互作用, 发现能双亲分子能引起DOPC膜的三维空间形态变化[11, 15]. 而QCM-D能够敏感地捕捉此动力学过程. Δf、ΔD分别反映着吸附层的质量和粘弹性变化. 实验步骤如图2A所示, 首先在二氧化硅衬底表面沉积囊泡以形成SLBs. 沉积平衡时的Δf～ -25 Hz和ΔD< 10-6表明形成了完整的SLB结构. 之后泵入表面活性剂溶液(C= 100 μM).

三种表面活性剂产生的膜响应具有显著区别. 对于Triton X-100, Δf大幅降低, 说明大量表面活性剂进入吸附层; ΔD显著增高, 说明表面活性剂引发磷脂膜明显的形态变化. 同时, 缓冲液漂洗后, Δf、ΔD可回落到初始值, 说明高耗散的结构与吸附层并非紧密相连, 可被溶液环境中的机械扰动分离开. 而对于CTAB与SDS, Δf、ΔD仅有小幅偏移, 表明仅有微量表面活性剂插入磷脂层, 造成了很低的膜耗散性提高. 在15 min的作用时间内, Triton X-100、CTAB、SDS引起的平均Δf偏移分别为-6.4、-1.2、-0.1 Hz, ΔD偏移分别为2.4、0.28、0.1510-6. 因此, 非带电性Trition-100能够诱导最为显著的膜变化.

随后, 改变了三种表面活性剂的溶液浓度, 在C= 10 - 100 μM范围内, 发现QCM-D的测量偏移量是与C直接相关的(图2B). 较高的C产生了较大的Δf、ΔD偏移, 说明表面活性剂物质的量是诱发磷脂膜形态变化的决定因素. 而当C10 μM, Δf、ΔD的偏移基本消失.

图2 QCM-D表征表面活性剂与SLBs的相互作用. (A) Δf - t 与ΔD - t 图. (B) 在SLBs与CTAB (红)、SDS (绿)、Triton X-100 (蓝)作用15 min后, Δf、ΔD的偏移.Fig. 2 QCM-D characterization of the interaction between detergents and SLBs. (A) Δf - t and ΔD - t curves. (B) Shifts of Δf, ΔD after 15 min interaction between SLBs and CTAB (red), SDS (green), and Triton X-100 (blue).

图3 SLBs与表面活性剂作用前后的荧光显微表征. (A) 完整SLB, 及其与(B) CTAB、(C) SDS、(D) Triton X-100作用15 min后的荧光显微图. 示意图中黄色、绿色、紫色、蓝色分别表示DOPC、CTAB、SDS和Triton X-100. 比例尺长度为10 μm. Fig. 3 Fluorescence microscopy imaging of detergent-induced membrane morphological responses. Fluorescence images of (A) intact SLB; 15 min after the interaction between the membranes and (B) CTAB, (C) SDS, (D) Triton X-100. Yellow, green, purple, and blue represent DOPC, CTAB, SDS, and Triton X-100, respectively. The scale bar represents 10 μm.

进一步在DOPC磷脂膜中掺杂1 mol% DiI染料, 荧光显微技术表征了表面活性剂作用前后SLB的形态变化. 如图3所示, SLB是一个均质的磷脂膜结构. 在与Triton X-100作用后, 膜表面形成了大量微泡出芽结构, 该结构可以被缓冲液漂洗除去. 而SLB与CTAB作用后, 表面出现了明暗光强不均的分布, 表明膜结构可能出现了非均的高度差异, 这在pH诱导的膜在组装中也被观察到[15]. SLB与SDS作用后变化最小. 因此, 荧光显微观测与QCM-D的结果一致, Triton X-100可诱发最为显著的膜形态变化.

我们对不同表面活性剂产生的效应差异进行了分析. CTAB与SDS分别带正电与负电, 而Triton X-100不带电(图1). 一方面, 由于自身分子间的静电排斥, 初始插入磷脂膜的SDS或CTAB会抑制进一步的表面活性剂进入, 从而使磷脂膜内的表面活性剂浓度限制在较低水平(较低的Δf偏移). 但插入分子产生的过量膜面积会造成膜弯曲[15], 形成高低不均的分子层结构(荧光非均质). 这使得分子间过量压力得以释放, SLB下侧的高耗散水增多(ΔD略增大). 另一方面, 由于自身分子间不存在静电排斥, 初始插入磷脂膜的Triton X-100不会抑制进一步的表面活性剂进入(较高的Δf偏移). 在过量膜面积与分子自发曲率诱导的富集效应[16]下, 更容易形成高曲率的高耗散出芽结构(较高的ΔD偏移和荧光出芽点). 这种出芽结构能够在外力的作用下失稳并脱离底面, 破坏磷脂膜的整体完整性.

最后, 考察了表面活性剂的模型膜响应行为是否影响到了细胞的正常生理功能. 在Hela细胞的DMEM培养液中加入了10 - 180 μM表面活性剂, 基于MTT实验表征细胞的活力. 发现Triton X-100在100 μM的浓度即可对细胞活性产生影响. 当CCTAB= 180 μM, 细胞活力下降(Vc)至80.2%. 而在实验浓度范围内, SDS与CTAB并未对细胞正常生理行为产生负面效应. 因此, Triton X-100产生的生物膜三维结构的再组装可能影响了细胞膜的稳定性与功能.

图4 MTT表征表面活性剂溶液环境中的Hela细胞活力.Fig. 4 MTT characterization of the effects of DDG and GML on human cell viability.

4结 论

在CMC以上表面活性剂与生物膜的作用与调控机制已经被深入研究了. 但以单体存在的表面活性剂如何与生物膜相互作用仍是一个开放的问题. 在本文中, 我们考察了三种不同离子型的表面活性剂与生物膜的相互作用. 研究发现, 在CMC以下, 非离子型Triton X-100能诱发最为显著的膜形态变化, 并引发细胞活力的异常. 机理分析表明, Triton X-100具有较弱的分子间静电排斥, 使得它更易大量地插入生物膜, 从而诱导形成高曲率的非稳出芽微泡结构. 而带电的CTAB或SDS由于分子间静电排斥, 限制了表面活性剂分子的大量插入, 从而降低了对膜形态和完整性的负面影响. 我们的研究深化了表面活性剂与生物膜作用机制的理解, 对表面活性剂在生物医药、膜组分萃取等领域的深化应用提供了指导与帮助.