HPLC-CAD法测定浓维磷糖浆中果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖含量

石蓉，粟贵，赵勇，谢莹莹

(湖南省药品检验研究院，湖南 长沙 410001)

浓维磷糖浆(Concentrated Divitamins and Sodium Phosphate Syrup，曾用名：维磷补汁)为复方制剂，是我国独有品种。本品用于自主神经功能紊乱引起的头晕目眩、精神疲倦以及低磷血症。浓维磷糖浆现行标准为WS-10001-(HD-1215)-2013，该标准规定蔗糖含量为60%(处方1)或45%(处方2)。蔗糖属于双糖类，其水溶液较稳定，但在酸环境下，加热后易水解生成葡萄糖与果糖。蔗糖在糖浆剂中主要是作为矫味剂以改善口味，高浓度的蔗糖还能起到抑菌作用。浓维磷糖浆剂中蔗糖成本占比较大，可能存在企业为降低成本而进行低量投料或替代投料，有研究发现部分企业采用麦芽糖代替蔗糖进行投样，或者将蔗糖与麦芽糖混合进行投样。而现行标准仅依靠相对密度法控制蔗糖含量，该方法专属性低，既不能区分糖的类别，更不能准确判断蔗糖的投料情况，存在一定的质量与监管风险[1-2]。

糖类化合物分子极性较强，因结构中缺乏生色官能团，紫外吸收较弱，目前国内外文献中常采用高效液相示差折光检测器(RID)、电喷雾检测器(CAD)和蒸发光散射检测器(ELSD)进行检测，由于RID灵敏度较低，易受温度和流动相的影响，无法进行梯度洗脱，在进行多组分分析时效果不理想[3-4]。而CAD 是一种通用型质量检测器，它基于雾化气溶胶原理，液相系统流出的洗脱液经雾化后形成颗粒，经过干燥后与带电氮气碰撞，将电荷转移至分析物颗粒表面，最后通过静电计测定分析物表面的电荷量[5-6]。该检测器相对RID和ELSD检测器，灵敏度更高、重现性更好，且具有对不同化合物响应一致的特点，用于分析测定单糖和二糖等低聚糖时有较好的效果[7-10]。

本研究采用高效液相色谱串联电喷雾检测器(HPLC-CAD)法测定浓维磷糖浆中果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖含量，通过分析测定结果，来评估浓维磷糖浆中蔗糖含量是否符合要求，对浓维磷糖浆的质量控制提供一定参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Dionex Ultimate 3000 型高效液相色谱仪；Corona Veo 电喷雾检测器(美国 Thermo Fisher Scientific 公司)；LC Solution色谱数据工作站(Chromeleon 7.2)；MS205 DU电子分析天平(Mettler Toledo公司)。

1.2 试药 乙腈(德国默克公司)为色谱纯，水为超纯水。果糖对照品(批号：100231-201606，纯度：99.7%)、葡萄糖对照品(批号：10833-201506，纯度：99.9%)、麦芽糖对照品(批号：100287-201303纯度：94.3%)、蔗糖对照品(批号：111507-201303，纯度：99.8%)，以上对照品均来自中国食品药品检定研究院。3批浓维磷糖浆分别来自A(批号：171101，长沙东风药业有限公司)、B(批号：1711182，湖北康源药业有限公司)、C(批号：20180913，湖北盛通药业有限公司)等3个厂家，均为自购样品。

2 方法

2.1 混合对照品溶液制备 分别精密称取果糖、葡萄糖、麦芽糖和蔗糖对照品适量，置同一量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(溶液中含果糖5.081 mg·mL-1,葡萄糖5.084 mg·mL-1,麦芽糖2.653 mg·mL-1,蔗糖7.828 mg·mL-1)。

2.2 供试品溶液制备 取本品0.1 g，精密称定，置10 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件 采用Alltech chrom Prevail carbohydrate ES 5u色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水(75∶25)，流速为1.0 mL· min-1，柱温为35 ℃，进样量为10 μL。Corona 电喷雾检测器:采集频率为10 Hz，滤光片为5 s，温度为35 ℃。

2.4 专属性试验 取对照品溶液(果糖和葡萄糖浓度约为0.5 mg·mL-1,蔗糖浓度约为0.75 mg·mL-1,麦芽糖浓度约为0.25 mg·mL-1)、供试品溶液以及空白溶剂各10 μL，按“2.3”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，结果显示空白溶液对样品测定无干扰，对照品和供试品溶液中各组分离良好，详见图1。

A.对照品；B.供试品 1.果糖(fructose);2.葡萄糖(glucose);3.蔗糖(sucrose);4.麦芽糖(maltose)图1 HPLC色谱图

2.5 标准曲线的绘制 取混合对照品溶液适量，用水定量稀释成系列测定溶液(其中果糖和葡萄糖浓度约为0.5、1、2、3、4、5 mg·mL-1；蔗糖浓度约为0.75、1.5、3、4.5、6、7.5 mg·mL-1；麦芽糖浓度约为0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·mL-1)，各精密量取10 μL，注入液相色谱仪测定，记录色谱图。

分别以各组分浓度为X轴，对应的峰面积为Y轴，绘制标准曲线。结果详见表1标准曲线测定结果表 。

2.6 检测限与定量限 取“2.5”项下标准曲线最小浓度溶液稀释合适倍数后进样，按信噪比(S/N)为3∶1计算，果糖、葡萄糖、麦芽糖和蔗糖的方法检测限分别为0.08、0.10、0.13、0.21 μg·g-1。按按信噪比(S/N)为10:1计算，以上组分的方法定量限分别为0.26、0.33、0.45、0.71 μg·g-1。

表1 标准曲线测定结果表

2.7 精密度试验 取“2.5”项下标准曲线溶液(其中果糖和葡萄糖浓度约为2 mg·mL-1,蔗糖浓度约为3 mg·mL-1,麦芽糖浓度约为1.0 mg·mL-1)，注入液相色谱仪测定，连续进样6次(n=6)，依法测定，以峰面积为考察指标，测得果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖峰面积RSD分别为1.5%、1.0%、0.6%、1.1%，说明进样精密度良好。

2.8 重复性试验 精密称取样品T9(批号：20180913)适量，按照“2.2”项下方法制备6份供试品溶液，测得果糖、葡萄糖和蔗糖的平均含量分别为 9.31%、9.54%、25.70%，RSD分别为1.78%、2.09%、1.91%。麦芽糖均未检出。

2.9 稳定性试验 取样品T9适量，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，于配制后0、2、4、8、12、24 h进样，测定果糖、葡萄糖、蔗糖峰面积RSD分别为1.9%、1.5%、2.4%。说明供试品溶液24 h稳定性良好。

2.10 回收率试验 取样品T9适量，精密称定6份，分别置10 mL量瓶中，分别精密加入果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖对照品适量，用水稀释至刻度，摇匀，依法测定，计算回收率，结果详见表2。

2.11 样品含量测定 取3批不同厂家样品，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定，根据标准曲线计算各组分含量，结果详见表3 样品测定结果比较。

3 讨论

3.1 色谱条件选择 本文采用乙腈-水作为流动相，当提高水相比例时有利于糖类的溶解，峰形比较尖锐，但不利于各组分的分离。而增加有机相会使峰形变宽，分析时间延长，通过分别采用乙腈-水(80∶20、75∶25、70∶30)3种比例流动相进行试验，结果显示当乙腈-水比例为 75∶25时，各组分完全分离，峰宽较小，分析时间适中，因此选择流动相比例为乙腈-水 (75∶25)进行试验。除此还分别考察了不同流速、柱温对试验结果的影响。分别采用0.8、1.0、1.2 mL·min-13种流速和 30、35、40 ℃ 3种柱温来考察其对试验结果的影响。结果显示当流速为1.0 mL·min-1保留时间合适，分离度较好，因此选择流速为1.0 mL·min-1。而柱温对保留时间、峰宽和分离度影响相对不大，为了进一步减少温差引起的波动，故选择检测器的温度(35 ℃)作为柱温。

表2 回收率试验结果表

表3 样品测定结果比较

3.2 样品测定结果分析 3批不同厂家样品中，均未检测出麦芽糖，蔗糖含量分别为31.34%、30.15%、25.70%，均远低于现行标准处方中蔗糖的含量(60%或45%)。除此，3批样品中均检测出葡萄糖和果糖，且葡萄糖和果糖含量相当，考虑可能是蔗糖的水解产物。蔗糖在酸环境下，加热后易水解生成单糖(葡萄糖与果糖)[11]。浓维磷糖浆剂的pH在4～6范围内，随放置时间的长短，此两种单糖在糖浆剂中都或多或少存在。单糖具有还原性，可延缓某些易氧化药物的氧化变质。但单糖过多对糖浆剂的稳定性也有一定影响。故对浓维磷糖浆剂在考察其蔗糖含量的同时，也应考察储存条件的影响，减少单糖的产生，保证其药品质量。