金银花与忍冬叶挥发油成分对小鼠淋巴细胞增殖效果研究

张文文，任英，张荣超，郝贵周

(鲁南贝特制药有限公司，中药制剂新技术研究中心，山东 临沂 271600)

金银花为忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥花蕾或带初开的花。具有清热解毒，疏散风热之功效，临床应用广泛，年需求量一般在万吨以上。化学成分多样[1-6]，药理作用广泛[7]；现已从金银花中分离出的化合物有145种，主要为有机酸类、黄酮类、环烯醚萜类化合物等[8]。现代医学研究证明,金银花药理作用主要表现在抑菌、抗病毒、解热、抗炎、保肝、止血、抗氧化、免疫调节等方面。忍冬叶作为新药源，年产量一般在数十万吨以上。与金银花相比，化学成分相似、临床功效基本相同。李时珍《本草纲目》曾记载“茎叶及花，功用皆同”，并且忍冬叶不受花期限制，四季均可采收。但各产区忍冬叶仍作为非药用部位被丢弃，造成了极大的资源浪费和经济损失。目前，国内外对忍冬叶进行了一定相关研究，但与金银花相比，其研究还不够深入，未能充分挖掘其药理功效及药效物质基础。因此，本文在传统水蒸气蒸馏基础上，采用水-有机溶剂多级蒸馏提取金银花及忍冬叶挥发油，进行成分对比分析，同时进行挥发油提取物的增强免疫作用研究，探讨金银花和忍冬叶挥发油对增强小鼠淋巴细胞增殖效果的影响。

1 仪器和试药

气相色谱-质谱联用仪(Agilent 6890/5973型)和 GC-MSD数据分析系统(NIST 05质谱库，WILEY 275质谱库，美国Agilent公司)；U-3000紫外-可见分光光度计(上海谱元仪器有限公司)；生物倒置显微镜(Olympus CKX41)，电子天平(JA2003)，酶标仪(Multiskan MK3)；二氧化碳培养箱(311，Thermo公司)，超净工作台(DL-CJ-1N)；立式压力蒸汽灭菌锅(LDZX-50KBS)；24孔、96孔细胞培养板(Costar公司)；胎牛血清(无噬菌体，低内毒素，杭州四季青)；PBS(凯基生物)；胰蛋白酶(凯基生物，不含Hank′s液，不含酚红)；DMEM高糖培养基(凯基生物，含双抗)；噻唑蓝(MTT，凯基生物)；Hank′s液(Solarbio公司)；PBS缓冲液(Hyclone公司)；刀豆蛋白A(ConA，Sigma公司)；2-巯基乙醇、盐酸、异丙醇、95% 乙醇、乙酸乙酯等均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

C57雄性小鼠，5～6周鼠龄，体重(20±2)g；购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，生产许可证号：SCXK(鲁)20140007。

金银花、忍冬叶均采自山东平邑郑城金银花GMP基地，经临沂大学辛杰老师鉴定分别为忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的花和叶。

2 方法与结果

2.1 挥发油样品制备 分别称取金银花及忍冬叶粗粉(40目)各300 g，料液比10∶1，浸泡2 h[9-13]，采用多级蒸馏装置(自制)，水-乙酸乙酯蒸馏，防止挥发油凝结在冷凝管，连续蒸馏12 h；得黄色乙酸乙酯液体，挥干有机溶剂。0.45 μm微孔滤膜过滤，4 ℃冰箱保存备用。

2.2 气相色谱-质谱(GC-MS)色谱条件 气相色谱柱：HP-5MS石英弹性毛细管柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升温，初始柱温60 ℃，以5 ℃·min-1升至260 ℃，保持10 min；进样口温度为260 ℃；载气：高纯氮，流速1 mL·min-1；分流进样，分流比10∶1，溶剂延迟4 min，进样量：1 μL。

质谱离子源:电子轰击(EI)离子源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃；扫描范围：40.00～500.00 amu；

2.3 淋巴细胞增殖试验 小鼠室温20～26 ℃，日温差≤4 ℃，相对湿度40%～70%，明暗交替时间为12/12 h，适应性喂养5 d后，随机分为10组，每组10只，按小鼠体重给药量不同，分为空白组、金银花和忍冬叶挥发油提取物(1 mg·kg-1)、金银花和忍冬叶挥发油提取物(2 mg·kg-1)、金银花和忍冬叶挥发油提取物(4 mg·kg-1)和阳性対照组(银耳孢糖胶囊)，0.1 mL·(10 g)-1，连续灌胃30 d后，测定免疫指标。小鼠末次给药后，脱颈椎处死，无菌取小鼠的脾脏置盛有Hank′s液的培养皿中，用注射器活塞研磨，使单个细胞游离出来，经200目筛网过滤，用Hank′ s液洗3次，每次离心10 min(1 000 rpm)。然后将细胞悬浮于2 mL DMEM完全培养液中，生物倒置显微镜下计数，调整细胞浓度为5×106/mL。将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1 mL，一孔加入75 μL ConA液，另一孔作为对照，置5% CO2、37 ℃培养箱中培养72 h。培养结束前4 h，每孔吸取上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含胎牛血清的DMEM培养液，同时加入MTT(5 mg·mL-1)50 μL，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入1 mL酸性异丙醇，吹打均匀使紫色结晶完全溶解，然后集中到96孔培养板中，在酶标仪上测定OD值，计算加ConA孔吸光度与不加ConA孔吸光度的差值。

2.4 分析方法 统计分析用SPSS 16.0软件。P<0.05为差异具有统计学意义。

2.5 金银花、忍冬叶挥发油提取率、成分及含量分析 采用自制多级蒸馏提取设备，金银花、忍冬叶挥发油提取率分别为0.69%、0.42%。经过GC-MS分析，得到挥发油总离子流色谱图(见图1～2)；采用NIST 05、WILEY 275标准质谱库对采集到的质谱图进行对比；通过文献检索、质谱分析进行化合物鉴定；通过色谱峰面积归一化法对化合物进行定量分析。最终得到金银花和忍冬叶挥发油成分及含量结果(见表1)。

分析表1可知，金银花及忍冬叶挥发油种类丰富，主要包括烷烃、烯烃、炔烃、醚、酯、脂肪酸、醇、醛、酮等，分别占到总挥发油含量的94.69%、95.02%。其次，各成分在金银花和忍冬叶挥发油中所占比例也不同，脂肪酸类分别占59.6%、60.48%，与其他文献相比[8-12]，采用自制多级蒸馏设备，脂肪酸类提取率明显升高；醇类分别占8.82%、9.14%；烷烃分别占5.17%、0.84%；酯类分别占8.17%、9.46%；烯烃分别占1.86%、2.7%；酮类分别占1.11%、1.24%；醛类分别占1.06%、2.37%；其他成分所占比例较小。各单体成分含量比较，金银花和忍冬叶中均以棕榈酸含量最高，分别占38.52%、43.77%；其次是亚油酸、芳樟醇、亚麻酸甲酯、月桂酸、硬脂酸、邻苯二甲酸二丁酯等；这说明金银花、忍冬叶挥发油在成分和含量上均具有较高的相似性。但同时，忍冬叶挥发油中14-甲基十五酸甲酯、香叶醇的含量较高，而金银花挥发油中烷烃类种类较多、含量较高，这说明两者之间也存在一定的差异性。

图1 金银花挥发油 GS-MS 总离子流

图2 忍冬叶挥发油 GS-MS 总离子流

2.6 挥发油成分对小鼠淋巴细胞增殖的影响 药理实验结果见表2、图3。与空白组比较，在体外培养条件下，金银花和忍冬叶挥发油在一定浓度范围内对小鼠脾淋巴细胞的转化均具有明显的促进作用，并呈现剂量与药效显著性正相关，即随药物浓度的升高，其药理作用不断增强。在药物剂量为1、2 mg·kg-1时，金银花挥发油和忍冬叶挥发油药理活性基本相同；在药物剂量为4 mg·kg-1时，忍冬叶挥发油活性显著增强。根据《保健食品检验与评价技术规范》的有关规定，金银花及忍冬叶3个剂量组结果为阳性，因此，判定挥发油成分具有细胞免疫功能。通过分析，发现忍冬叶挥发油的促淋巴细胞增殖活性均高于金银花挥发油，这为进一步开发忍冬叶这一新药源提供了一定的科研思路。

表1 金银花、忍冬叶挥发油成分及含量

表2 淋巴细胞增殖测定结果(n=10)

图3 挥发油成分对小鼠淋巴细胞增殖的影响效果

3 讨论

结合大生产中金银花挥发油易于凝结在冷凝管壁的现象，在传统水蒸气蒸馏基础上，通过实验设备改进，采用水-有机溶剂多级蒸馏提取的方式，大大提高了金银花及忍冬叶挥发油提取率。通过GC-MS分析发现，金银花与忍冬叶挥发油在种类及含量上存在一定相似性，均主要包含烷烃、烯烃、炔烃、醚、酯、脂肪酸、醇、醛、酮等成分；且均以脂肪酸类成分含量最高。同时，两者也存在一定差异，忍冬叶挥发油中烷烃种类和含量相对较少。

金银花挥发油药理作用广泛，本研究采用脾淋巴细胞转化实验，对比了金银花和忍冬叶挥发油对免疫功能的药效作用。结果显示，在一定浓度范围内。金银花和忍冬叶挥发油成分均表现出明显的免疫增强作用，且忍冬叶的免疫活性作用相对更强。上述研究为忍冬叶新药源及保健开发提供了一定理论基础，但仍需进一步明确其药理机制。