赖氨酸磷酸氢钙颗粒评价性抽验结果及质量评价

咸瑞卿，王聪聪，巩丽萍，石峰

(1.山东大学药学院，山东 济南 250012；2.山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101)

赖氨酸磷酸氢钙颗粒是由盐酸赖氨酸、磷酸氢钙和适宜辅料制成的复方制剂，主要用于生长发育促进以及钙质的补充[1]。2018年，我们对全国范围内抽取的167批赖氨酸磷酸氢钙颗粒进行了法定标准检验，包括性状、鉴别、检查及含量测定，结合探索性研究，对检验结果进行统计分析，用于风险评估，为今后质量标准及临床用药安全的提高提供参考。

1 抽样情况

1.1 药品剂型、规格与包装材料 此次抽检的赖氨酸磷酸氢钙颗粒为混悬颗粒，标示规格均为含盐酸赖氨酸0.1 g、磷酸氢钙0.1 g，包装规格均为每袋5 g，内包装均为药用复合膜。

1.2 药品抽样情况 从国家药品监督管理局网站查询，目前赖氨酸磷酸氢钙颗粒的生产企业共有16家，药品批准文号16个。本次共抽取167批次(148个生产批次)，涉及生产企业10家，占总生产企业的62.5%，涉及10个批准文号，占总文号数的62.5%，未涉及的批准文号共有6个，占总文号数的37.5%。企业调研结果显示，6家企业长期不生产，存在文号闲置的情况。本次抽验覆盖27个省(自治区、直辖市)，来自各类经营企业(89.2%)、医疗单位(0.6%)和生产企业(10.2%)，代表性较强，能较好地反映反应全国赖氨酸磷酸氢钙颗粒质量现状。

2 法定检验

现行《中国药典》《美国药典》《英国药典》《欧洲药典》《日本药局方》中均未收载赖氨酸磷酸氢钙颗粒的质量标准。现有15家企业执行国家标准，另1家企业执行注册标准，两者主要在处方项目上有所差异，且注册标准另含有其他氨基酸检查、溶出度检查及干燥失重3项检查项目。本次抽样样品均执行国家药品标准，对167批次的赖氨酸磷酸氢钙颗粒按法定质量标准进行检验，所有项目均符合规定，合格率为100%。

2.1 性状 167批次样品均为类白色或淡黄色颗粒，味甜，合格率为100%。但不同企业样品颜色存在差异(见图1)，除与个别企业处方中的柠檬黄色素有关外，还与颗粒干燥工艺中干燥温度和时间相关，干温度过高或时间过长会使颗粒颜色加深。其中J企业不同批次间颜色差异显著，说明该企业生产工艺不稳定或不按照批准的处方工艺生产，结合企业提供的处方工艺资料，企业可能存在擅自添加着色剂的问题，需进一步开展探索性研究。

图1 不同企业赖氨酸磷酸氢钙颗粒的外观性状

2.2 鉴别 本品的鉴别反应均包含以下两项：①化学鉴别：利用茚三酮与α-氨基加热反应产生蓝紫色物质的原理来鉴别赖氨酸；②化学鉴别：钙盐和磷酸盐鉴别。167批次样品鉴别结果均符合规定。

我们在法定检验中发现现行质量标准存在以下问题：①采用茚三酮显色反应鉴别赖氨酸，方法的专属性不强，无法区别其他氨基酸，需进一步建立专属性强、灵敏性高的赖氨酸鉴别方法；②因磷酸氢钙在中性水溶液中不溶，且盐酸赖氨酸的氯离子对磷酸盐鉴别①有干扰，因此现行赖氨酸磷酸氢钙颗粒各质量标准的磷酸盐和钙盐的方法灵敏低，鉴别现象不易观察，需对现行标准进行修订。

2.3 装量差异 按《中国药典》2015年版(四部)通则0104进行检验，取本品10袋，分别精密称定每袋装量并计算平均装量。单样本Kolmogorov-Smirnov Z(K-S)检验表明167批样品的装量检测结果呈较好的正态分布，平均装量分布在4.610 0 g～5.206 0 g之间，装量平均值为4.995 0 g/袋(见图2)，均符合平均装量±7%的规定限度。从不同企业的装量差异箱线图(见图3)来看，各企业的平均装量离散性均较小，但G企业出现有1批次较大离异值，说明该企业颗粒分装工艺稳定性有待提高。

图2 装量统计结果直方图

2.4 粒度 按《中国药典》2015年版(四部)通则0104颗粒剂项下的规定，取本品5袋，照粒度和粒度分布测定法(第二法双筛分法)测定，不能通过一号筛与能通过五号筛的总和不得超过15%。经过检验，167批次样品的粒度均符合规定，样品合格率100%。

2.5 含量测定

2.5.1 磷酸氢钙(CaHPO2·2H2O) 依据质量标准，采用EDTA滴定法对167批样品的磷酸氢钙进行含量测定，并对结果进行统计分析(见图4)。由图可见磷酸氢钙含量分布在94.6%～106.9%之间，平均含量为99.78%，K-S检验表明含量呈良好的正态分布，均符合90.0%～110.0%的规定。根据箱线图(见图5)，A企业样品含量分布范围较宽，B及E企业的含量分布相对集中，但分别有2批及4批样品有较大离异值。经过对比，两家企业样品中出现较大离异值的样品平均装量均未有异常离异值，且这些批样品均属于不同的批次，说明企业的产品含量均一性仍需要加强控制。

图3 装量统计结果箱线图

图4 磷酸氢钙含量直方图

图5 磷酸氢钙含量箱线

2.5.2 盐酸赖氨酸(C6H14N2O2·2HCl) 盐酸赖氨酸含量采用紫外-可见分光光度法进行测定，结果表明(见图6)盐酸赖氨酸含量分布在91.3%～107.4%之间，平均含量为99.07%，K-S检验表明含量呈良好的正态分布，167批样品结果均符合85.0%～115.0%的标准规定。根据箱线图(见图7)，各企业均未出现较大离异值，A企业的样品含量分布范围略宽于其他企业。

图6 盐酸赖氨酸含量直方图

图7 盐酸赖氨酸含量箱线图

现行国家药品标准采用UV法(比色法)进行含量测定，该方法受试剂、温度、反应时间等因素影响较大，方法的重现性差、专属性不强，且限度范围设置过宽，不能客观准确的的反映产品的真实含量。因此，在探索性研究中需要建立一种专属性更好的含量测定方法，对产品质量进行进一步的研究，并合理设定限度范围。

3 探索性研究及结果

本次研究紧紧围绕赖氨酸磷酸氢钙颗粒剂存在的安全性、有效性问题，以及现行质量标准存在的科学性与合理性问题，以企业提供的处方工艺信息资料为依据，以法定检验突出的质量问题为导向，结合专题调研、文献检索发现的问题，对影响药品安全性、有效性及稳定性等关键因素展开了探索性研究。

3.1 赖氨酸鉴别试验 现行赖氨酸磷酸氢钙颗粒质量标准均采用茚三酮显色反应鉴别赖氨酸，该方法专属性不强，无法区别其他氨基酸。针对上述问题，我们参考文献，建立了柱前衍生HPLC法鉴别赖氨酸的方法[2-3]。专属性试验研究显示该方法空白辅料、衍生化试剂及其他氨基酸均无干扰，方法专属性良好(见图8)。使用该方法对167批次样品进行赖氨酸鉴别，合格率100%。

图8 专属性试验色谱图

3.2 有关物质研究 现行国家标准中赖氨酸磷酸氢钙颗粒未对有关物质进行控制，故有必要建立更适宜的方法考察赖氨酸原料及制剂中的有关物质，从而保证产品的安全性。目前，国内外文献对赖氨酸杂质研究报道较少，国内外药典仅检查盐酸赖氨酸原料中其他氨基酸含量。我们根据文献报道，选择赖氨酸中可能存在的杂质如D-赖氨酸、其他氨基酸及其他杂质，考察样品中的含量，必要时建立限度检查。

3.2.1 D-赖氨酸 手性固定相色谱技术是对映异构体分离的一种有效方法[4]。本研究采用大赛路手性色谱柱，以高氯酸水溶液为流动相，检测波长为205 nm，对D-赖氨酸进行分析。本方法中，D-盐酸赖氨酸和L-盐酸赖氨酸的分离度大于3.0，检测限均约为0.025 μg(见图9)。通过该方法，对9家企业27批盐酸赖氨酸颗粒进行了测定，典型样品色谱图见图10，均未检出D-赖氨酸，合格率为100%，因此制剂中无须设定该项限度检查。

图9 DL混合赖氨酸色谱图

图10 D-赖氨酸检查典型样品色谱图

3.2.2 其他氨基酸的测定 我们采用氨基酸分析仪，使用茚三酮进行柱后衍生，胱氨酸检测波长440 nm，其余均为570 nm，对其他氨基酸进行测定。本方法各氨基酸之间分离度大于1.5，胱氨酸检测限<16 pmol，其他氨基酸<3 pmol，各氨基酸对照品色谱图见图11。通过该方法对9家企业27批盐酸赖氨酸颗粒进行测定，典型样品色谱图见图12，均未检出其他氨基酸，合格率为100%，因此制剂中无须设定该项限度检查。

图11 混合氨基酸对照品色谱图

图12 其他氨基酸检查典型样品色谱图

3.3 赖氨酸含量测定 高效液相色谱(HPLC)法具有分离度高、选择性好等特点，越来越广泛地应用于氨基酸的分析测定中。其中，柱前衍生与HPLC结合已成为氨基酸分离分析的有力工具之一[4-5]。我们以2,4-二硝基氟苯为衍生化试剂，使用甲醇-0.05 mol·L-1醋酸钠缓冲液为流动相，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，在360 nm波长下进行检测，建立了盐酸赖氨酸磷酸氢钙颗粒中L-盐酸赖氨酸含量测定方法，并对167批样品的赖氨酸含量进行测定。从直方图中(见图13)可以看出，全部样品的含量分布在93.2%～105.7%之间，平均含量为100.48%，合格率100%。对拟定方法(HPLC法)与法定方法(UV法)测定结果进行比较，用两种方法含量测定结果整体无显著性差异(见图14)，其中拟定方法测定的结果偏差较小，较法定标准测定值偏高。拟定方法测定结果具有更好的中位数分布，数据更加集中，离群值较明显，能够更好地区分相同厂家不同批次产品的批间差异。此外，结合拟定方法，建议将本品盐酸赖氨酸(C6H14N2O2·2HCl)含量修订为“应为标示量的90.0%～110.0%”。

3.4 颗粒剂干燥失重考察 赖氨酸磷酸氢钙颗粒为化学药品颗粒，根据《中国药典》2015年版制剂通则颗粒剂项下要求需检查干燥失重，现行国家标准WS-10001-(HD-0389)-2002中干燥失重检查项缺失。我们对收集的所有颗粒剂样品，按《中国药典》2015年版(四部) “干燥失重检查法”对颗粒剂干燥失重进行测定，考察各企业工艺稳定性。

10家生产企业共167批样品的测定结果表明，干燥失重平均值为0.76%，其中I企业有1批不合格，合格率为99.4%。对数据分析发现有76.0%的样品干燥失重值小于1.0%，说明大部分企业的产品干燥工艺选择适宜。

图13 盐酸氨酸含量结果直方图

图14 盐酸氨酸含量测定结果对比图

3.5 辅料使用合规性考察 我们通过处方工艺调研，发现部分生产企业现行生产处方与所执标准的处方不一致，且未能提供处方变更或备案的有效证明文件，存在擅自更改处方，违规或超限使用辅料的风险，因此我们选择可能存在风险的着色剂、枸橼酸、葡萄糖、乳糖、蔗糖及淀粉等固体制剂常用辅料，对其使用情况进行了考察。结果显示，167批次颗粒剂中25批次检出处方外辅料成分，不合格率为15.0%。

3.5.1 着色剂 针对法定检验中发现各企业产品甚至同一企业不同产品颜色差异显著，可能存在违规添加着色剂的问题，参考文献，我们建立了液相色谱测定赖氨酸磷酸氢钙颗粒中柠檬黄和日落黄的方法[6]。前期处方工艺调研显示，除D企业生产颗粒处方有柠檬黄外，其他企业处方中均无柠檬黄。但J企业21批样品中有15批检出了柠檬黄，提示该企业可能存在非法添加辅料柠檬黄的行为。其他企业样品均未检出柠檬黄，与资料一致。全部样品均未检出日落黄及阿司帕坦。

3.5.2 枸橼酸 我们通过建立的高效液相色谱-二极管阵列检测器测定赖氨酸磷酸氢钙颗粒中枸橼酸含量的方法，对167批样品中的枸橼酸含量进行测定，并进一步采用高分辨质谱对阳性样品进行确认。结果发现D企业有8批次样品检出了枸橼酸(见图15)，含量为(0.853±0.180)mg·g-1，但该企业提供的生产处方无枸橼酸，提示该企业存在擅自添加辅料行为。其他企业均未检出枸橼酸，与提供的生产处方一致。

3.5.3 葡萄糖、蔗糖及乳糖含量考察 参考文献，我们建立了高效液相色谱-示差折光法对赖氨酸磷酸氢钙颗粒中葡萄糖、蔗糖及乳糖含量考察[7]。对检验结果及企业处方进行分析，结果显示F企业抽检的4批样品中两批样品的总糖量分别为604和603 mg·g-1，低于其执行处方中蔗糖的处方量(800 mg·g-1)，而另外两批次总糖含量与处方量基本一致。结合这两批次装量差异均符合规定，进一步分析，该企业这两批次产品中添加了约20%的其他辅料成分，存在违规使用辅料的风险。其他各生产企业糖含量均与处方一致。

3.5.4 淀粉 通过葡萄糖、蔗糖及乳糖含量考察发现G企业生产的两批产品糖含量显著偏低，并且在化学鉴别和溶出度考察试验中均出现大量酸不溶性沉淀，与另外有两批次产品存在显著性差异，提示该企业可能存在改变工艺处方、擅自改变辅料的问题。

我们进一步对颗粒剂中酸不溶物进行研究，化学鉴别显示该沉淀灼烧可燃，水中加热呈半透明糊状，加碘试液变，初步推断该辅料可能为淀粉。拉曼光谱具有快速简单的特点，广泛应用于药物分析领域[8]。因此，我们进一步采用拉曼光谱进行分析，通过搜库比对两批次样品(见图16A)均与淀粉的拉曼光谱(见图16B)高度相似，相似度0.99，因此判断两批次样品中添加了淀粉，约占处方总量的20%，这与糖含量测定结果相一致，提示该企业产品批间差异显著存在变更处方中辅料情况。

3.6 近红外光谱快检方法研究 近红外光谱分析技术近年来发展迅速，具有简单、快速和重现性好等优点，是药品的快速检测的有效方法[9]。此次我们将收集到的10家企业的167批颗粒剂样品进行近红外光谱扫描。大于等于3批的样品建立一致性检验模型，小于3批的样品建立相关系数模型。并用其他企业相同剂型相同规格的样本进行验证。结果发现G企业颗粒剂建立的一致性检验模型通过了验证(见图17),其余9家企业都不能通过验证，结果不理想。建立的相关系数模型，都能将其他企业的样本有效地区分，模型通过验证。

图15 D企业典型样品一级质谱和二级质谱图

图16 G企业产品(A)与可溶性淀粉(B)拉曼光谱图

图17 G企业近红外一致性检验模型验证

此外，在以E等企业样本作为参照光谱分别建立一致性模型，用F企业的4批样本作为验证光谱进行验证时发现，4批次样品中有2批均区分良好，而另外2批无法有效区分(见图18A)。进一步以F企业均区分良好的2批作为参照光谱建立一致性模型，无法有效区分的2批样本光谱作为验证光谱进行验证，结果发现参照光谱和验证光谱区分良好(见图18B)，说明辽F企业不同批次检样品处方工艺存在显著差异，与辅料使用合规性研究中发现的F企业2批次颗粒剂中糖的含量仅为处方量的75%，且添加有占处方总量20%淀粉的结果相一致。

图18 F企业近红外一致性模型比较图

4 总结

4.1 总体评价 通过本次抽检的167批次赖氨酸磷酸氢钙颗粒，结合现行标准检验、探索性研究及综合评分的结果表明，赖氨酸磷酸氢钙颗粒整体质量状况“差”。现行标准存在鉴别方法不可行、鉴别及含量测定方法专属性差、主要控制项目缺失(干燥失重)、限度设置不合理等问题，质量标准总体评价为“差”。本次评价抽验发现的问题主要集中在质量标准、处方工艺等方面，可能对药品质量的安全性、有效性及稳定性产生不同程度的影响。

4.1.1 质量标准问题 本品种按法定标准检验，合格率均为100%，按照探索性研究方法检验，合格率为83.8%，不合格项目为干燥失重和不按处方投料，提示颗粒剂现行质量标准不能满足质量控制的要求。目前质量标准存在问题有：①现行标准缺少颗粒剂溶出度、干燥失重等主要控制项目；②赖氨酸鉴别与含量测定的方法专属性差、重现性差，无法区别其他氨基酸，测定结果不能客观反映产品中的真实含量；③颗粒剂中钙盐、磷酸盐鉴别方法存在干扰且灵敏度不高；④颗粒剂盐酸赖氨酸限度过宽，不能有效控制产品质量。

4.1.2 违规违法生产问题 本次结合法定检验及探索性研究结果，发现以下违规违法生产问题：①G企业颗粒剂执行标准为WS-10001-(HD-0389)-2002，但其生产处方中原料投料量仅为标准处方量的20%，按照其说明书的用法用量，有效剂量偏低；②J企业21批颗粒剂中15批检出柠檬黄，与提供的生产处方不一致，擅自添加着色剂；③D企业8批颗粒剂中均检出枸橼酸，与提供的生产处方不一致，擅自添加矫味剂或抗氧剂；④F企业4批颗粒剂中2批检出淀粉，含量高达20%，提示该企业产品批间差异显著，擅自采用淀粉替代部分蔗糖投料。

4.1.3 其他问题 此外我们还发现以下几个其他问题：①I企业和J企业产品包装说明书不规范；②I企业1批颗粒剂微生物限度不合格，1批干燥失重不合格；③盐酸赖氨酸、磷酸氢钙与蔗糖均为粗品经精制获得，粗品生产过程不在药品监管范围内，起始原料的质量不可控。

4.2 解决问题的建议 针对本次抽检发现的问题我们提出以下几点建议：①建议现行标准修订鉴别检查、增订缺失项目、采用专属性强、灵敏度高的鉴别和含量测定方法，设定合理的含量限度范围；②建议企业严格按照批准的处方工艺进行生产，不得擅自变更辅料；加强生产工艺质量控制，降低微生物污染风险；③建议企业加强包装材料质量控制，规范使用包装及说明书；④建议监管部门对存在问题的生产企业进行检查，以督促企业严格执行GMP及《药品管理法》的相关规定；⑤建议监管部门加强原辅料粗品的质量监管，开展原辅材料质量控制、工艺控制、产品质量检测及产品储存环境质量控制水平专项检查。