雷酚内酯对IgA肾病大鼠肾间质纤维化和Th1/Th2漂移的调控①

宋献美 吴晓东 杨 亮 李宁宁

(河南医学高等专科学校微生物与免疫学教研室，郑州 451191)

IgA肾病(IgA nephropathy，IgAN)是临床上常见的一种自身免疫性疾病，其病理特点为肾小球系膜区IgA或以IgA为主的免疫球蛋白颗粒样或团块状沉积[1]。研究表明，IgA肾病患者体内Th1/Th2细胞的平衡紊乱与IgA肾病的发生密切相关，并会进一步加重肾脏损伤[2]。以往认为该病预后良好，但近年发现儿童在确诊后的5～25年内9%～50%进行性发展为终末期肾病，成人患者每10年约有20%进展至终末期肾病[3,4]。IgA肾病进展至终末期肾病的危险因素包括血尿、蛋白尿、肾功能不全、肾小球硬化、肾小管纤维化等[5,6]。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是目前发现的最强致纤维化细胞因子，在IgA肾病患者肾组织中，TGF-β1的表达与肾小管损伤及间质纤维化程度呈正相关[7]。雷公藤及其制剂是确有疗效的免疫抑制剂，其抗炎和免疫抑制作用已通过大量实验被确证，用于治疗关节炎、系统性红斑狼疮、肾病等[8,9]。雷酚内酯(化学式结构式见图1)是从雷公藤分离得到的二萜类有效成分，具有较强的免疫抑制活性[10]，但其对肾病的作用尚不清楚。本研究主要目的是通过IgA肾病大鼠模型，探索雷酚内酯对IgA肾病肾功能、肾间质纤维化和Th1/Th2漂移的影响，明确雷酚内酯对IgA肾病的作用。

1 材料与方法

1.1材料 45只SPF级6周龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠购自河南省实验动物中心。雷酚内酯购自南京道斯夫生物科技有限公司。牛血清白蛋白(albumin bovine serum，BSA)、脂多糖(lipopolysacch-arides，LPS)购自美国Sigma公司。四氯化碳购自天津市大茂化学试剂厂。肌酐(creatinine，Cr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)购自南京建成生物工程研究所。ELISA试剂盒(IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ)购自北京索莱宝科技有限公司。FITC荧光标记兔抗大鼠IgA抗体购自美国Dako公司。TGF-β1、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemot-actic protein-1，MCP-1)抗体购自英国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1动物分组及处理 45只大鼠随机分为3组，每组15只：正常对照(Control，Ctrl)组、模型(IgA nephropathy，IgAN)组、雷酚内酯(triptophenolide，TN)组。模型组和雷酚内酯组大鼠以10% BSA隔日灌胃(400 mg/kg)共6周；于第6周和第8周末尾静脉注射LPS(0.05 mg/只)； 每周1次皮下注射四氯化碳0.1 ml+蓖麻油0.3 ml，共9周。正常组大鼠于相应时间给予生理盐水皮下和尾静脉注射，等体积蒸馏水灌胃。从第10周开始，雷酚内酯组大鼠灌胃雷酚内酯(3 mg/kg)，正常组和模型组灌胃蒸馏水，每日1次，连续8周。

图1 雷酚内酯化学结构式Fig.1 Chemical structure of Triptophenolide

1.2.2尿蛋白和肾功能指标检测 末次给药后代谢笼收集各组大鼠24 h尿液，考马斯亮蓝法检测尿蛋白；收集待测大鼠血液，离心分离血清，肌氨酸氧化酶法检测血清肌酐，二乙酰肟比色法检测血清尿素氮。

1.2.3血清中炎症因子水平的测定 末次给药24 h后，采集大鼠血液，离心分离血清，按试剂盒说明书，采用ELISA法检测血清中IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10的含量，并计算IL-4/IFN-γ比值。

1.2.4免疫荧光观察IgA的沉淀 末次给药24 h采血后取出大鼠肾脏，用OCT包埋后，放入液氮速冻，制成4 μm厚的冰冻切片，晾干，PBS缓冲液漂洗3次，每次3 min，滴加FITC标记的IgA抗体(1∶50)，37℃ 孵育30 min，PBS漂洗3次，甘油封片，荧光显微镜下观察IgA在肾组织中的沉淀情况。

1.2.5肾组织病理观察 肾脏组织经中性甲醛固定，石蜡包埋，切片，常规HE染色，于显微镜下观察肾组织病理学形态。Masson三色染色后，观察肾组织的纤维化程度，胶原纤维呈蓝色，采用Image-Pro Plus 6.0软件进行半定量分析，以胶原纤维在肾组织的面积百分比表示肾脏组织的纤维化程度。

1.2.6肾组织TGF-β1和MCP-1表达检测 用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取肾组织总蛋白，BCA法定量蛋白浓度。变性后等量蛋白经10% SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜，随后加入5%的脱脂奶粉室温封闭2 h，弃去封闭液，漂洗后加入相应一抗，4℃过夜，第二天滴加二抗室温封闭1 h，洗膜后加入ECL显色液置于暗夹内曝光显影。用Image J对蛋白条带进行半定量分析，以β-actin为内参。

1.3统计学方法 采用SPSS22.0软件对数据进行分析，多组之间的比较采用单因素方差分析(One-way analysis of variance，One-way ANOVA)，两组间比较采用LSD检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1雷酚内酯对IgAN大鼠肾组织IgA沉淀的影响 利用免疫荧光检测大鼠肾组织中IgA的沉积，如图2所示。正常组大鼠肾组织未见IgA免疫荧光反应；模型组大鼠肾小球系膜区呈较强的团块状或颗粒状绿色强IgA荧光，说明IgA肾病大鼠模型建立成功；雷酚内酯干预后，IgA沉淀绿色荧光显著减弱。由此可见，雷酚内酯可减少IgA在大鼠肾组织的沉积。

2.2雷酚内酯对IgAN大鼠肾组织形态学和纤维化的影响 HE染色显示，正常组大鼠肾脏肾小球、肾小管、肾间质未见明显异常，系膜区无明显增生；模型组大鼠部分肾小球增大，肾小囊腔扩大，系膜组织增生，系膜基质增多，肾小管上皮细胞肿胀、肾小球内细胞增多；雷酚内酯组病变程度较模型组明显减轻，见图3。Masson染色显示，正常组大鼠肾小球、肾小管及间质组织病理形态未见异常，系膜区基质及细胞未见增加，肾组织鲜有蓝色胶原纤维着色区域；模型组可见中到重度不同程度细胞及基质增生，部分肾小球基底膜、系膜区见蓝色线条状区域，在肾间质小管处可见斑块条状蓝色区域散在分布，血管胶原纤维也呈蓝色着色；雷酚内酯组病变程度较模型组明显改善；模型组胶原纤维面积百分比高于正常组，雷酚内酯组胶原纤维面积百分比低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

2.3雷酚内酯对IgAN大鼠肾功能的影响 正常组、模型组、雷酚内酯组大鼠血清中肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白水平比较差异有统计学意义(P<0.05)，模型组和雷酚内酯组大鼠血清中肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白含量高于正常组，雷酚内酯组大鼠血清中肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白水平低于模型组(P<0.05)。见图5。上述数据表明，雷酚内酯可改善IgAN大鼠的肾功能。

图2 雷酚内酯对IgA在大鼠肾组织沉积的影响(免疫荧光，×400)Fig.2 Effect of TN on IgA deposition of renal tissue in IgAN rats(Immunofluorescence,×400)

图3 雷酚内酯对IgA大鼠肾组织形态学的影响(HE，×200)Fig.3 Effect of TN on morphology of renal tissue in IgAN rats(HE,×200)

2.4雷酚内酯对IgAN大鼠血清Th1/Th2漂移状态的影响 与正常组比较，模型组大鼠血清中IL-2和IFN-γ水平明显下降(P<0.05)， 而IL-4和IL-10水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，雷酚内酯组大鼠血清中IL-2和IFN-γ水平明显升高(P<0.05)，IL-4、IL-10水平及IL-4/IFN-γ比值明显降低(P<0.05)。结果见图6。上述结果说明，雷酚内酯可提高Th1型、降低Th2型细胞因子水平，从而纠正IgA肾病大鼠Th1/Th2漂移现象。

图4 雷酚内酯对IgAN大鼠肾纤维化的影响(Masson，×200)Fig.4 Effect of TN on renal interstitial fibrosis in IgAN rats(Masson,×200)Note:Compared with control group,*.P<0.05;compared with IgAN group,#.P<0.05.

图5 各组大鼠肌酐、尿素氮和尿蛋白的比较Fig.5 Comparison of Cr,BUN and urine protein in ratsNote:Compared with control group,*.P<0.05;compared with IgAN group,#.P<0.05.

图6 TN对IgAN大鼠血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平及IFN-γ/IL-4比值的影响Fig.6 Effects of TN on levels of IL-2,IFN-γ,IL-4,IL-10 and IFN-γ/IL-4 in serum of IgAN ratsNote:Compared with control group,*.P<0.05;compared with IgAN group,#.P<0.05.

图7 雷酚内酯对IgAN大鼠肾组织TGF-β1和MCP-1表达的影响Fig.7 Effect of TN on expression of TGF-β1 and MCP-1 in renal tissues of IgAN ratsNote:Compared with control group,*.P<0.05;compared with IgAN group,#.P<0.05.

2.5雷酚内酯对IgAN大鼠肾组织TGF-β1和MCP-1表达的影响 Western blot结果显示，与正常组比较，模型组大鼠血清中肾组织TGF-β1和MCP-1表达明显增加(P<0.05)，与模型组比较，大鼠血清中肾组织TGF-β1和MCP-1表达水平明显降低(P<0.05)，结果见图7。上述结果表明，雷酚内酯可减少IgAN大鼠肾组织TGF-β1和MCP-1的表达。

3 讨论

IgA肾病的重要发病机制是以IgA为主并常伴有C3、IgG等免疫复合物在肾系膜区的沉积，研究发现系膜区沉积的IgA或血清中升高的IgA均为多聚型IgA1[11]。大量证据表明由于铰链区的α-糖基化异常使得IgA1易于自我聚集，或与针对IgA1铰链区的IgG抗体形成抗原抗体复合物，并与纤维连接蛋白等细胞外基质的亲和力增加，形成的含免疫球蛋白的大分子复合物沉积于系膜区[12]。蛋白尿是IgA肾病患者最常出现的临床症状，同时也是引起肾小管间质损害、导致肾功能异常的因素之一[13]。本实验采用联合牛血清白蛋白+脂多糖+四氯化碳的方法建立模型，免疫荧光显示模型大鼠肾小球系膜区出现弥漫性颗粒状沉淀，呈强绿色荧光，符合IgA肾病的病理特征。尿蛋白、血清肌酐、尿素氮检测结果显示模型大鼠上述指标较正常大鼠均明显升高，表明IgA肾病模型建立成功。雷酚内酯干预后，IgA在大鼠肾组织的沉积明显减少，尿蛋白、血清肌酐、尿素氮水平明显下降。

机体的Th0辅助细胞可分化为Thl细胞和Th2细胞亚群，其中Th1细胞主要分泌IFN-γ、IL-2、IL-12等因子介导细胞免疫应答，而Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等因子介导体液免疫应答。Th1和Th2细胞因子分别诱导Th0细胞向各自细胞亚群分化并促进其细胞激活，正常情况下Th1/Th2处于动态平衡状态，亦称为促炎/抗炎平衡。但当机体出现病变或者免疫系统异常时，Th1/Th2平衡遭到破坏，发生Th1/Th2平衡失调，使Th1/Th2漂移。

临床研究显示IgA肾病患者体内Th2细胞免疫应答增强，而Th1细胞免疫应答减弱，发生Th2漂移[14]，Th2细胞及Th2型细胞因子的增加，一方面诱导B细胞活化成熟产生异常糖基化的IgA，对IgA糖基化的形式产生影响，另一方面抑制Th1细胞及Th1型细胞因子分泌，从而抑制Tc细胞介导的细胞凋亡及免疫应答，影响抗原的清除[1,15]。Th2型细胞因子的增高还可降低单核吞噬细胞系统的清除能力使IgA肾病患者的IgA及其免疫复合物不能被及时清除，增加在肾小球系膜区的沉积，引起系膜细胞与基质增生，加重肾损伤[16]。MCP-1属于趋化因子CC亚家族，其主要功能是趋化和激活单核细胞至炎症部位。正常肾组织仅含有少量的MCP-1，当肾脏受到刺激时，MCP-1表达增加，其趋化巨噬细胞在肾小管间质聚集，并激活巨噬细胞产生多种促炎因子及促纤维因子，是IgA肾病的危险因素[7,17]。本实验发现IgA肾病大鼠血清中IL-2 和IFN-γ水平明显降低，而IL-4、IL-10水平和IL-4/IFN-γ比值明显升高，MCP-1表达增加，说明IgAN模型组大鼠体内Th细胞向着Th2细胞方向极化，体液免疫增强，Th1/Th2发生漂移；雷酚内酯干预后大鼠血清中IL-2和IFN-γ水平升高，IL-4、IL-10水平及IL-4/IFN-γ比值降低，MCP-1表达减少，结果表明雷酚内酯可提高Th1类、降低Th2类细胞因子水平，抑制MCP-1的表达，从而纠正IgA肾病大鼠的Th1/Th2漂移。

IgA在肾小球系膜的沉积促使系膜细胞分泌MCP-1、IL-2、IL-6等多种细胞因子，并促发一系列瀑布式级联炎症反应，导致肾小球硬化、肾间质纤维化。肾间质纤维化是多种肾脏疾病的共同且不可逆的病理改变，是肾脏疾病进展至终末期肾病的共同通路，因此延缓肾纤维化的发生是慢性肾病治疗的关键[18,19]。研究表明IgA肾病患者的TGF-β1表达量明显上调，且与肾小球硬化程度呈显著正相关[20]。TGF-β1不但参与抗体IgA的产生，而且被公认为最重要的促纤维化因子，是治疗肾小球硬化和肾小管间质纤维化的关键靶点。TGF-β1主要通过TGF-β1/Smad信号通路发挥作用，Smad2是激活型Smad蛋白，为TGF-β1下游调节因子，与TGF-β1受体形成复合物，磷酸化后释放并与Smad4结合，激活细胞外基质成分等启动子的活性，促使细胞外基质合成增加。Smad7则起负反馈调节的因子，Smad7表达量减少，Smad通路的活性增强，肾脏呈进展性纤维化[21,22]。因此，抑制TGF-β1的产生可通过TGF-β1/Smad信号通路减缓肾纤维化的进展过程。本实验显示IgA肾病大鼠肾间质可见胶原纤维分布，胶原纤维面积百分比明显升高，TGF-β1表达增加；雷酚内酯处理后大鼠肾间质胶原纤维分布减少，胶原纤维面积百分比和TGF-β1表达降低。

综上所述，雷酚内酯可减少IgA在大鼠肾系膜区的沉积，改善肾功能和肾组织病理，抑制肾间质纤维化，纠正Th1/Th2平衡的漂移。因为TGF-β1/Smad信号通路是调控组织纤维化的经典通路，因此，在后期实验中我们将继续探讨雷酚内酯通过TGF-β1/Smad通路对IgA肾病肾间质纤维化的影响。