在线液相色谱-气相色谱/质谱联用快速分析烟叶中的西柏三烯二醇

黄 志, 毕艳玖, 沙云菲, 谢雯燕, 吴 达, 刘百战, 刘太昂

(1.上海烟草集团技术中心,上海200082;2.上海大学材料科学与工程学院,上海200444)

西柏三烯二醇是烟草中重要的西柏烷类化合物(cembranoids),主要存在于烟叶和烟花的表面分泌物中[1-3].作为重要的致香前体物,大部分西柏三烯二醇在调制和陈化过程中会降解生成茄酮等香味成分,因而对烟叶的香气风格和品质具有重要影响[4-5].与此同时,西柏三烯二醇还具有抑制肿瘤生长、抗菌、调节植物生长以及抑制尼古丁感受等作用[6-9],因而受到许多研究人员的关注,成为了一个非常热点的研究对象.对西柏三烯二醇进行分析研究,不仅可以提升对烟叶内在品质的认识,而且对烟草衍生产品的开发也具有重要的应用价值.

烟叶表面的西柏三烯二醇有两个异构体,分别为α-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇(αcembratrien-4,6-diol,α-CBT-diol)和β-2,7,11-西柏三烯-4,6-二醇(β-CBT-diol)[10].Severson等[11]利用二氯甲烷提取烟叶表面分泌物,然后采用气相色谱/质谱(gas chromatography/mass spectrometry,GC/MS)联用技术实现了α-CBT-diol和β-CBT-diol的有效分离鉴定.烟草行业中已有的西柏三烯二醇推荐标准检测方法需要经过复杂的前处理操作以及衍生化反应步骤,极易造成样品损失,导致检测结果的可靠性较低[12].Ren等[13]尝试采用紫外检测高效液相色谱(high performance liquid chromatography-ultraviolet,HPLC-UV)对西柏烷类化合物进行检测,但由于样品化学成分复杂、干扰较大,检测分析的效果并不理想.

本研究针对行业标准检测方法中前处理步骤复杂的问题,建立了以超声波辅助溶剂萃取技术[14],结合在线液相色谱-气相色谱/质谱(liquid chromatography-GC/MC,LC-GC/MS)联用技术[15]对烟草中的西柏三烯二醇进行快速分析的方法.超声波辅助溶剂萃取技术可以实现烟草样品西柏三烯二醇的快速提取.在线LC-GC/MS系统的第一维凝胶渗透液相色谱不仅可以实现样品的大体积进样,提高检测的灵敏度,同时也可以有效去除会对西柏三烯二醇分析产生不利影响的干扰物质,起到简化样品前处理的作用.同时,第二维GC/MS分析亦可进一步实现对西柏三烯二醇异构体的有效分离分析,为烟草样品中西柏三烯二醇的快速高效分析提供重要的技术支撑.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

本实验所用试剂及材料如下:正十七烷醇(n-heptadecanol,NHE)和二十烷酸甲酯(methylicosanoate,MAA)购自美国Acros Organics公司;N,O-双-三甲基三氟乙酰胺V(BSTFA)：V(TMCS)=99：1(纯度为98%)、二氯甲烷(色谱纯)、乙腈(色谱纯)购自TEDI公司;其余试剂均为分析纯.实验所用烟叶样品由上海烟草集团有限责任公司技术中心提供.

本实验所用仪器如下:Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司);Vortex-Genie 2多功能旋涡混合器(美国Scientific Industries公司);AE200型电子分析天平(感量为0.000 1 g,瑞士Mettler Toledo公司);真空干燥箱(美国Thermo Scientific公司);RJ-LDL-50G多管离心机(中国瑞江公司).在线LC-GC/MS联用系统中第一维液相仪器为Agilent 1290液相色谱仪(美国Agilent公司),配备自动进样器、二元泵、二极管阵列检测器(diode-array-detector,DAD);第二维气相仪器为Agilent 7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司),配备On-Column进样口.

1.2 烟叶中西柏三烯二醇的提取

取新鲜烟叶冷冻干燥后粉碎,过80目筛,筛下物为实验用烟样粉末,-20°C冷藏,备用.称取0.5 g烟样粉末置于100 mL锥形瓶中,加入15 mL乙腈和100μL含100μg/mL MAA的乙腈溶液,超声萃取30 min后经0.22μm滤膜过滤.所得滤液浓缩至1 mL置于4°C备用.

1.3 西柏三烯二醇的BSTFA硅烷化衍生

吸取100μL西柏三烯二醇提取液于样品瓶中,加入100μL V(BSTFA)：V(TMCS)=99：1,涡旋震荡3 min,在75°C下密闭衍生化反应30 min.反应完成后冷却至室温进行GC/MS分析.

1.4 LC-GC/MS分析

液相色谱条件:上样量为10μL,色谱柱为Waters Styragel HR 0.5凝胶色谱柱(5μm×300 mm×4.6 mm i.d.),流动相为二氯甲烷,流速为0.25 mL/min,柱温为30°C.DAD检测波长为254 nm.

气相色谱条件:采用VDB-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25μm)毛细管色谱柱分离,载气为氦气,柱流速为1.2 mL/min,升温程序为40°C保持14 min,以20°C/min升温至210°C,接着以0.5°C/min升温至220°C,然后以15°C/min升温至300°C,保持5 min.

质谱条件:传输线温度为280°C,离子源温度为230°C,四级杆温度为170°C,溶剂延迟20 min,电离方式为电子轰击离子(electron impact ion,EI)源,电离能量为70 eV,质量扫描范围为50～800 amu.

2 结果与讨论

2.1 烟叶中西柏三烯二醇的LC-GC分析

烟草中西柏三烯二醇分子的分子量为306.凝胶色谱是根据物质的相对分子质量大小进行区分的.相对分子质量大的保留时间较短,相对分子质量小的保留时间较长.因此,在线LC-GC/MS联用系统中的第一维凝胶渗透色谱不仅可以保证西柏三烯二醇衍生物分子在相对窄的时间窗口内出峰,同时也可以有效地去除复杂样品体系中对仪器和西柏三烯二醇分析结果有不利影响的色素等大分子物质,起到净化烟叶西柏三烯二醇样品的作用.与此同时,相较于已有的复杂繁琐的提取过程,本实验的前处理过程更为简单快速,灵敏度和效率也很高,更适用于大批量样品的分析测试.

由于西柏三烯二醇目前尚未有商品化的标准品,质谱标准谱库中也没有相对应的谱图,因此给西柏三烯二醇分子的质谱定性分析造成了一定的困难.本实验选用浙江东昌的烤后香料烟烟叶,经过前处理后进行测定分析,并对比分析了已有数据[16]与本实验中所得的质谱碎片,确定了2个西柏三烯二醇分子异构体α-CBT-diol和β-CBT-diol三甲基硅烷化后的EI特征碎片离子(见图1和表1),并以此为基础对西柏三烯二醇分子进行LC-GC定位研究.

2.2 烟叶中西柏三烯二醇的LC-GC定位

本实验对西柏三烯二醇提取液进行了在线LC-GC/MS分析,图2为第一维液相分离所得的色谱图.本实验以1 min为切割单位,对第一维色谱图中的保留时间区域7～13 min进行第二维GC/MS分析,初步筛选出西柏三烯二醇衍生物在第一维分离中的保留时间区域为10～11 min.为了进一步确定西柏三烯二醇衍生物在第一维分离中的保留时间区域,本实验以0.1 min为时间调整单位,考察了西柏三烯二醇衍生物在9.5～10.0 min以及11.0～11.5 min这两个保留时间区域的出峰情况,确定了西柏三烯二醇衍生物在第一维分离中的保留时间区域为9.9～10.9 min(见图2中的虚线部分).

图1 西柏三烯二醇分子三甲基硅烷化后特征碎片离子EI质谱Fig.1 EI mass spectra of characteristic ions of cembratriene-diols after trimethylsilanation in

表1 西柏三烯二醇分子三甲基硅烷化后的EI质谱特征碎片离子Table 1 Characteristic ions of cembratriene-diols after trimethylsilanation in EI mass spectra

图2 西柏三烯二醇的第一维LC分离色谱图Fig.2 Chromatogram of cembratriene-diols in the first dimensional LC seperation

根据西柏三烯二醇衍生物在EI质谱的碎裂特点,第二维分离选用了选择离子扫描(select ion moniring,SIM)模式进行GC/MS分析,所得质谱图如图3所示,定性以及定量离子如表2所示.由图3可以发现,在保留时间区域28.0～30.5 min之间出现了2个西柏三烯二醇分子的衍生化色谱峰.这表明西柏三烯二醇衍生物分子的保留时间区域主要在28.0～30.5 min之间,可基于此进行后续的方法学考察以及实际样品分析.

2.3 所构建方法的线性、重复性和回收率考察

由于西柏三烯二醇尚未有商品化的标准品,本实验选取了与西柏三烯二醇分子量相近且同样需要硅烷化衍生的NHE进行方法的线性及回收率考察.在相同条件下对同一样品进行9次平行测定.结果显示,西柏三烯二醇的2个异构体α-CBT-diol,β-CBT-diol和NHE测定值的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)分别为0.57%,0.72%和0.86%,表明这一方法具有良好的重现性.

图3 西柏三烯二醇的第二维GC/MS分析色谱图Fig.3 Chromatogram of cembratrene-diols in the sencond dimensional GC/MS analysis

表2 三甲基硅烷化西柏三烯二醇在第二维GC/MS分析中的保留时间以及定性定量离子Table 2 Retention time,quantitative and qualitative ions of cembratriene-diols after trimethylsilanation in the sencond dimensional GC/MS analysis

准确称取NHE 500 mg,精确至0.1 mg,用乙腈溶解后分别置于10 mL容量瓶中,加入乙腈定容,摇匀,得到标准贮备液.分别准确稀释NHE标准贮备液,得到0.01～0.10μg/μL之间不同质量浓度梯度的NHE标准溶液,并将不同质量浓度的NHE标准溶液加入到烟叶样品中进行LC-GC/MS分析.采用内标法定量,以NHE与内标MAA的峰面积比为纵坐标(y),NHE质量浓度为横坐标(x,μg/μL)进行回归分析,得到NHE质量浓度的回归方程为y=8.53×10−5x,相关系数为R2=0.999 3.这一结果表明,本实验构建的在线LC-GC/MS方法所得NHE质量浓度结果具有良好的线性关系.

取一定量的NHE加入到已知NHE质量浓度的烟叶样品中,并按低、中、高3个浓度水平进行NHE的添加.将添加与未添加标样的样品平行进行前处理和定量分析,并进行加标回收率的测定,结果如表3所示.可知,NHE的加标回收率在85.13%～92.47%之间.这一结果表明,本实验所构建的在线LC-GC/MS方法可满足烟叶样品中西柏三烯二醇的定量要求.

表3 NHE的加标回收率Table 3 Recoveries of standard addition of NHE

2.4 不同烟叶中西柏三烯二醇含量的比较分析

本实验将上述方法应用于不同地区K326青烟叶中西柏三烯二醇含量的比较分析中,其中4种样品分别为2013年云南昆明宜良K326中部成熟期青烟叶、2013年云南玉溪江川K326中部成熟期青烟叶、2013年河南襄县K326中部成熟期青烟叶以及2013年贵州遵义K326中部成熟期青烟叶.每个样品均为两组平行测定,经过简单前处理后进行在线LC-GC/MS分析,所得不同产地K326中部成熟期青烟叶中西柏三烯二醇的相对含量对比结果如图4所示.

图4 不同产地K326中部成熟期青烟叶中西柏三烯二醇的相对含量Fig.4 Relative amounts of cembratriene-diols extracted from central part of fresh K326 tobacco leaves from diあerent planting areas

由于α-CBT-diol和β-CBT-diol只是分子结构上具有差异性,二者的质谱响应值基本相同,因此本实验以2013年云南昆明宜良K326中部成熟期青烟叶的α-CBT-diol测定结果为基准,分别对所有样品的西柏三烯二醇分子含量进行了归一化处理.由图4可知:青烟叶中α-CBT-diol的含量均低于β-CBT-diol,昆明宜良样品中的西柏三烯二醇含量最低,贵州遵义的含量最高.分析国家气象科学数据共享服务平台的相关信息可知:云南昆明以及玉溪为亚热带季风气候,2013年7—8月间的降水多,因而极易导致烟叶生长过程中西柏三烯二醇等表面物质含量降低;河南襄县2013年8—9月的气温高,降水不多,使得烟叶生长过程中西柏三烯二醇等表面物质含量较高;而贵州遵义2013年4—5月的降水偏少,因此西柏三烯二醇等表面物质含量损失较少,测得的含量最高.

3 结束语

本实验构建了一种快速分析烟草中西柏三烯二醇含量的方法.样品首先经过超声波辅助溶剂萃取,之后通过在线LC-GC/MS对烟草中的西柏三烯二醇进行分析.整个萃取过程简单便捷,在线LC-GC/MS分析的RSD低于1%,回收率高于85%,表明整个定量分析具有较高的可靠性.比较分析了不同地区K326青烟叶中西柏三烯二醇含量,发现青烟叶中α-CBT-diol的含量均低于β-CBT-diol,且与种植地区的气候条件呈现较强的正相关性.这一结果也进一步表明,本实验所构建的方法适用于烟草中西柏三烯二醇含量的大规模快速分析处理.