深低温冷冻保存同种异体前交叉韧带移植免疫研究*

张 培 刘 泉 周建生 朱 坤 赵 皓 项 平

1 蚌埠医学院第一附属医院骨科,安徽省蚌埠市 233000; 2 组织移植安徽省重点实验室

关节镜下交叉韧带重建是目前临床治疗交叉韧带损伤常用的方法[1]，移植物的选择临床各异。同种异体前交叉韧带(Anterior cruciate ligament，ACL)移植重建因免疫排斥反应破坏了移植体的结构，影响移植的疗效，术后如何更好地抑制免疫排斥反应仍是大家研究的课题。既往研究有相关方面报道[2]，然而异体韧带移植后局部和全身反应的机理报道较少，本课题从受体对移植物的免疫排斥反应方面入手，采用深低温冷冻保存同种异体大鼠ACL修复ACL损伤，对比分析局部与全身免疫的差异和水平，探索同种异体交叉韧带移植后宿主对移植物的免疫反应情况，进而为异体交叉韧带移植后指导免疫抑制剂的合理应用，提高临床疗效。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠60只，鼠龄6～8周，体质量250～300g，由蚌埠医学院实验动物中心提供，通过蚌埠医学院第一附属医院动物伦理委员会批准，实验过程中对动物处置严格遵守国家科学技术部2006年《关于善待实验动物的指导性意见》的要求。动物传染病检查双后肢、膝关节X线骨科检查正常。

1.2 动物分组 从60只大鼠中按照随机数字表方法随机选择15只大鼠，切取30个后肢ACL标本，再将30个ACL标本按随机数字表方法随机分为冷冻保存组和常温保存组，每组15个。余45只大鼠采用随机数字表方法分三组，每组15只：A组采用正常自体移植物， B组采用冷冻保存的同种异体移植物，C组采用非冷冻保存异体组织移植物。

1.3 实验方法

1.3.1 ACL的切取与保存。动物术前禁食、禁水8h，术前30min予阿托品0.5mg/kg肌注，采用3%戊巴比妥钠1ml/kg行腹腔注射麻醉。麻醉生效后固定于手术台上，手术严格按无菌要求操作，后肢双侧全膝关节剃毛，常规消毒、铺巾。15只大鼠双膝关节外侧纵形切口，切开关节囊，将髌骨向内侧脱位，显露并切取ACL。切取的30个ACL随机分为冷冻保存组和常温保存组。冷冻保存组15个标本经D-hank’s液漂洗后放入盛有1.5ml冷冻保护液(二甲基亚砜10%，DMEM 40%，小牛血清50%)的冻存管中，在4℃冰箱中平衡30min，移入-40℃冰箱，以0.5～1℃/min速度降至-40℃，维持2h，再投入-196℃液氮中保存2周。其余15个标本常温保存。

1.3.2 ACL的移植重建。ACL的切除：45只大鼠取右侧后肢膝关节外侧长约1.0cm的纵切口，关节囊外侧打开，使髌骨内侧脱位。在ACL止点处切除ACL，检查前抽屉试验及Lachman试验阳性，术时注意保护关节面、关节软骨、后交叉韧带及髌下脂肪垫。

ACL的移植重建：大鼠右侧后肢膝关节屈曲100°，进行ACL的移植。A组：将切取的ACL再次植入，制作正常自体ACL移植重建模型。B组：将冷冻保存组的ACL冻存管置37℃水浴箱1min内快速复温解融，取出ACL用D-hank’s液漂洗3次，清除低温保护剂。然后将ACL移植，制作冷冻保存同种异体移植组动物模型。C组：将常温保存异体ACL植入，制作非冷冻保存异体组织移植。移植韧带两端用0号丝线缝合固定，检查重建韧带位置良好后，同时检查前抽屉试验及Lachman试验阴性，以数码相机拍摄移植后移植韧带情况。关节内稀碘伏冲洗后再用大量生理盐水冲洗膝关节腔及伤口，缝合伤口，包扎。

1.3.3 术后处理。45只大鼠术后肌注1次青霉素(4×107U/L)1ml抗感染，待SD大鼠清醒后曲马多(10mg/kg)止痛，分笼饲养，伤口消毒换药，自由进食水。

1.4 观察指标

1.4.1 一般情况：观察术后动物精神状态、饮食及伤口愈合情况。

1.4.2 细胞免疫因子水平测定：在术后12、24、48h，每组随机选择5只大鼠，麻醉成功后抽取血液及手术侧的关节液，采用双抗体夹心ABC-ELISA法测定关节局部组织液与血清中TNF-α、IL-2、IL-6水平。同时采用瑞氏染液染色，显微镜下观察记录关节局部组织液与血清中吞噬细胞功能检测，计数测定不同时间点吞噬细胞的吞噬率和吞噬指数变化[3]。吞噬率(%)=(吞噬有细菌的吞噬细胞数)/(计数的100个吞噬细胞)×100%，吞噬指数=100个吞噬细胞所吞噬的细菌总数/计数的100个吞噬细胞。

1.4.3 组织学观察：处死动物，取出移植韧带，在显微镜下观察韧带色泽、弹性、滑膜包裹和血管浸润情况，以及关节软骨、半月板等结构退变情况。

2 结果

2.1 一般情况 术后0.5～1h，所有大鼠苏醒，实验动物均能够自由觅食，体质量变化比较差异无显著性(P>0.05)。A、B组伤口均愈合良好，C组5例出现伤口红肿，2例有少量感染渗出，均经过换药处理后愈合，实验大鼠均无死亡。

2.2 大体及显微组织学观察 在每个观察节点，A、B组移植韧带光泽明亮，周围出现极少量的未侵入组织内的淋巴细胞，未发现组织坏死状况，移植韧带结构清晰，胶原排列有序，弹性良好。C组移植韧带光泽相对较暗，韧带表面絮状物附着，炎性细胞浸润，韧带弹性相对A、B组差。

2.3 细胞免疫因子测定

2.3.1 实验动物血清TNF-α水平比较：在术后的每个观察时间点，A组、B组TNF-α水平基本相同，差异无显著性(P>0.05)，而每个观察时间点，A组、B组TNF-α水平明显高于C组(P<0.01)，见表1。实验动物关节液中TNF-α水平比较：在术后的每个观察时间点，A组、B组TNF-α水平基本相同，差异无显著性(P>0.05)，而每个观察时间点，A组、B组TNF-α水平明显高于C组(术后12h时P<0.05，术后24h、48h时P<0.01)。在纵向比较发现，关节局部组织液中TNF-α水平增幅明显高于血清中(P<0.01)。

表1 术后不同时间点各组大鼠血清、关节液TNF-α水平比较

注： A组、B组与同时间点C组比较，aP<0.05，bP<0.01。

2.3.2 实验动物血清IL-2、IL-6水平比较：在术后每个观察时间点，A组、B组IL-2、IL-6水平基本相同，差异无显著性(P>0.05)，而每个观察时间点，A组、B组IL-2、IL-6水平明显高于C组(P<0.01)，见表2。

2.3.3 实验动物关节液吞噬细胞吞噬率、吞噬指数比较：在术后每个观察时间点，A组、B组吞噬细胞吞噬率、吞噬指数基本相同，差异无显著性(P>0.05)，而每个观察时间点，A组、B组吞噬细胞吞噬率、吞噬指数明显高于C组(P<0．01)，见表3。

表2 术后不同时间点各组大鼠血清IL-2、IL-6水平比较

注：A组、B组与同时间点C组比较，aP<0.01。

表3 术后不同时间点各组大鼠关节液吞噬细胞吞噬率、吞噬指数

注：A组、B组与同时间点C组比较，aP<0.01。

3 讨论

前交叉韧带是膝关节重要的稳定结构，可以防止膝关节过伸、限制胫骨前移、控制胫骨旋转和维持股骨与胫骨稳定的对应关系，当ACL损伤时一般难以自行修复[2]，可引起不同程度的膝关节不稳及功能受限，如不及时处理将继发膝关节半月板退行性变，引起创伤性关节炎的发生[4]。

移植物的安全是前交叉韧带重建成功的关键环节[5-6]，交叉韧带重建以自体组织移植的效果较理想[7]，但其会出现供区损伤等并发症，同时存在翻修术时移植物来源缺乏问题，因而常常无法满足临床需求。近年来同种异体交叉韧带重建有所发展，并且是自体组织良好的替代物[8]，而移植后的免疫排斥反应则会严重影响移植效果，因而如何降低并监测异体移植物的免疫原性，抑制移植后排斥成为异体移植物重建前交叉韧带成功的关键[9]，一般来说，为避免移植排斥反应常采用深低温冷冻处理移植物来消除抗原[10]，同时可以在术后应用免疫抑制剂，由此在临床上就需要考虑到如何应用抑制剂及其剂量的调整、使用时间和应用的效果的判断。本实验研究发现，在术后每个时间的观察点，A组、B组移植物大体观察相似，TNF-α、IL-2水平比较无差异(P>0．05)，C组低于A组、B组，差异有明显的显著性(P<0．05)，IL-2的主要生物学功能是促进T细胞的增殖与分化，这说明深低温处理的异种移植物T细胞介导免疫反应明显减弱，T 细胞活化明显降低，表明引起较微弱的细胞免疫反应，具有较小的免疫原性，所以引发的排斥反应十分微弱，破坏性小，而未经冷冻处理的移植物有明显的抗原性，与既往学者研究结果相同[11]，本实验中IL-2和TNF-α均同时得到增长，说明在免疫调节方面发挥着协同增效作用。IL-6是通过激活效应细胞或继发性释放其他细胞因子来直接或间接地实现免疫效应，本实验中IL-2与IL-6出现同步升高，一定程度上说明在免疫应答中起到相互协同作用。

新鲜异体移植物的免疫反应强烈，经冷冻处理可灭活、破坏活细胞，降解移植物供体细胞表面的抗原结构，从而减轻免疫反应。吞噬细胞包括外周血中的中性粒细胞和单核细胞以及多种器官、组织中的巨噬细胞，在免疫应答、效应及调节过程中起重要作用。本实验结果显示，C组吞噬细胞吞噬率和吞噬指数明显低于A组、B组，表明C组免疫细胞因子的水平明显降低，更加抑制机体体液免疫反应。A组、B组比较差异无显著性，表明深低温处理后可以有效预防细胞免疫因子的抑制，同时A组、B组植入物周边仅存在少量淋巴细胞浸润，未发现组织坏死现象。而C组移植物遭到破坏，局部淋巴细胞浸润明显，引起免疫排斥反应，由此冷冻处理可以明显改变肌腱细胞表面的抗原性，同时局部免疫较全身免疫反应较快，说明局部的免疫指标可以更好地反应关节的炎症反应，进而指导临床用药。

异体移植物的转归对于ACL重建后的生物学功能有着重要的作用，因ACL的转归是影响移植物转归的重要因素，移植物的转归受诸多因素的影响，诸如骨隧道内不同填充物的介入[12]、不适当的康复计划[13]、手术时机的选择[14]，另外解剖重建与等长重建[15]、交叉韧带残端的保留情况[16]，由此促进移植物的转归研究各异，同种异体移植物的处理方法、移植的手术方法、来源等是影响移植物转归主要原因[17]。经过冷冻处理的同种异体移植韧带可以避免供区疼痛、感染等并发症，相对自体肌腱移植患者疼痛以及关节僵硬概率更小，所以冷冻处理同种异体肌腱移植为大多数术者及患者接受[18]，本实验采用两步冷冻保存同种异体ACL重建，对比研究证实深低温冷冻保存能够很好地清除异体ACL表面抗原，最大限度减轻免疫排斥反应，促进移植物的转归，这与既往学者研究结果相同[19]。

综上所述，深低温冷冻保存能够很好地减轻免疫排斥反应，其局部较全身的免疫排斥反应相对较明显，进而为临床更早、更有效地观察移植后免疫排斥情况开辟新的途径，更有利于免疫抑制剂的合理应用，然而细菌、病毒可能是潜在的传染源[20]，并且远期反应尚需要进一步研究。