黑龙江省东部地区汉族人群PCSK9基因第1外显子多态性与脂代谢的相关性

赵晓辉 许嘉彬 王秀艳 王立波

(1佳木斯大学附属第一医院心内一科，黑龙江 佳木斯 154002；2深圳大学第一附属医院(深圳市第二人民医院)心内科)

冠状动脉粥样硬化性心脏病(CAHD)是指冠状动脉血管发生粥样硬化导致管腔内出现狭窄甚至闭塞，使得心肌细胞缺血缺氧甚至坏死而引发的一种心脏病，简称冠心病(CHD)，也称缺血性心脏病(IHD)〔1〕。研究表明，CHD的发生与多种危险因素有关，包括年龄、性别、吸烟、高血压、高血脂和糖尿病等。在这些危险因素的作用下，由多种细胞及因子相互作用形成复杂的网络共同参与疾病的发生发展过程，其中脂代谢异常是重要的因素之一〔2〕。前蛋白转化酶枯草溶菌素(PCSK)9是近年来发现的另一个与脂代谢相关的基因，且不同基因型可以导致低胆固醇血症或高胆固醇血症的发生，这可能是CHD的新致病因素〔3〕。本文研究PCSK9基因多态性在人群中分布特点及其与脂代谢的关系。

1 材料与方法

1.1研究对象 选取佳木斯大学附属第一医院2016年12月至2017年12月因心绞痛和(或)运动试验阳性及有冠脉管腔狭窄的证据而需要入院进一步行冠状动脉造影(CAG)者220例。病例组为经CAG确诊为CHD的患者共110例，对照组为非CHD患者共110例。病例组与对照组均男69例，女41例。病例组平均年龄(60.12±10.05)岁，对照组(60.03±10.03)岁，差异无统计学意义(t= 0.067，P=0.947)，病例组与对照组各个年龄层分布差异无统计学意义(<50岁：18例 vs 16例；50～59岁：33例 vs 37例；60～69岁：39例 vs 35例；≥70岁：20例 vs 22例；χ2=0.658，P=0.883)。受试对象在接受试验之前均被详细告知研究相关风险及注意事项并签署知情同意书。 排除标准：非黑龙江省东部地区人(非自幼生长于本地区者)、非汉族人群、肿瘤、炎症、心肌梗死、心力衰竭、脑梗死或短暂性脑缺血发作、肝肾疾病和甲状腺疾病及其外周血管疾病。

1.2流行病学调查及样本收集 收集并整理所有研究对象的年龄、性别、吸烟、饮酒、高血压和糖尿病等基线资料，均于空腹12 h后用普通生化管抽取外周静脉血2 ml用于血脂的检测，并借助全自动生化分析仪进行血脂水平的检测；另外用含乙二胺四乙酸(EDTA)的采血管抽取研究对象外周静脉血3 ml用于DNA的粗提取。

1.3PCSK9基因第1外显子测序及A53V位点多态性分析 采用聚合酶链反应(PCR)检测。

1.3.1基因组DNA提取 取EDTA采血管中的血液样本400 μl，按照Solarbio全血基因组DNA提取试剂盒说明书要求提取基因组DNA。

1.3.2PCR扩增目的基因片段 使用软件DNAman设计并合成PCSK9基因第1外显子引物，挑选任意5个DNA样本对目的基因片段进行PCR 扩增并通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小，上游引物：5′-TTCCAGCCCAGTTAGGATTTG-3′,下游引物：5′-CCCAAGATCGTGCCAAGCGAAG-3′。PCR体系(25 μl)：上、下游引物各0.5 μl，dNTP混合物(10 mmol/L)0.5 μl，Taq DNA聚合酶(5 U/μl)0.3 μl，ddH2O 17.2 μl，缓冲液A 5.0 μl，目标DNA 1.0 μl；反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，上述步骤循环30次，72℃10 min，16℃ 30 min。扩增产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳进行验证。

1.3.3基因序列测定 应用全自动DNA测序仪进行正反向测序，测序结果使用SnapGene软件与Gen Bank数据库中的PCSK9基因序列进行比对，确定突变位点。

1.4统计学分析 采用SPSS22.0统计软件进行t检验；Hardy-Weinberg遗传平衡χ2检验及单因素方差分析、LSD-t检验或TamhaneT2检验。

2 结 果

2.1两组临床资料的比较 病例组吸烟、高血压、糖尿病人数均显著多于对照组(P<0.05)；血清TG、TC和LDL-C水平均显著高于对照组(P<0.05)，HDL-C显著低于对照组(P<0.05)；两组饮酒人数差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

组别吸烟〔n(%)〕饮酒〔n(%)〕高血压〔n(%)〕糖尿病〔n(%)〕TG(mmol/L)TC(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)病例组49(44.55)35(31.82)57(51.82)35(31.82)2.47±1.464.82±1.071.28±0.282.78±0.84对照组31(28.18)28(25.45)23(20.91)12(10.91)2.01±1.624.49±1.061.42±0.442.56±0.81t或χ2值6.3641.09022.70714.3132.2112.281-2.8412.055P值0.0120.2960.0000.0000.0280.0240.0050.041

2.2PCSK9基因第1外显子PCR扩增结果 以DL2000 Marker作为标准带进行比对，各扩增条带与设计的引物片段大小相同(图1)。

1～5均为样本图1 PCSK9基因第1外显子PCR产物凝胶电泳

2.3PCR扩增产物测序结果 经过序列比对共发现6个突变位点(表2、图2)。

表2 PCSK9基因序列突变筛查结果

“-”目前尚无相关研究或文献报道

图2 PCSK9第1外显子突变位点测序峰

2.4两组PCSK9基因A53V位点基因型和等位基因频率的比较 共检测出CC和TC两种基因型，未检测到TT基因型。采用HWE软件进行Hardy-Weinberg吻合度检验表明PCSK9基因A53V位点上的等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡。PCSK9基因A53V位点以CC基因型为主，而等位基因主要是C。与对照组相比，病例组C基因型频率较低，而T基因型频率较高；两组C等位基因频率均高于T等位基因频率。两组基因型分布和等位基因频率差异均有统计学意义 (P<0.01)。见表3。

2.5组内各基因型血脂水平比较 病例组和对照组各基因型间血清TG、TC、HDL-C和LDL-C水平差异显著(P<0.05)。病例组中TC基因型血清TG、TC和LDL-C水平均显著高于CC基因型(P<0.05)，而血清HDL-C水平低于CC基因型，但差异无统计学意义(P>0.05)；对照组中TC基因型血清TG、TC、HDL-C和LDL-C水平均高于CC基因型，仅血清TC水平差异具有统计学意义(P<0.05)。两组同基因型血清TG、TC、HDL-C和LDL-C水平差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表3 PCSK9基因A53V的等位基因频率和基因型频率的比较 (n=110)

表4 两组不同基因型组间血脂水平比较

与CC相比：1)P<0.05，2)P<0.01

3 讨 论

CHD病理学基础是动脉粥样硬化(AS)。流行病学调查结果显示，CHD已成为西方发达国家人口死亡的主要原因，而近年来我国的CHD患病率也呈现逐年上升的态势。传统观点认为，年龄、性别、吸烟、高血压、糖尿病和血脂异常等因素均为CHD的危险因素，与CHD的发病具有密切关系。此外，近年来发现遗传因素在CHD发病中具有重要的作用，一些血脂相关基因可能与早发心血管疾病有关。CHD发病率在不同的种族人群，甚至是同一生活条件下同种族不同个体中也存在差异，提示遗传因素可能是CHD患病的另一个重要因素。PCSK9是近几年来才被发现的家族性高胆固醇血症相关基因，其编码蛋白具有促进肝细胞表面LDL受体降解的作用，可以抑制LDL-C在体内被清除代谢，使得血清LDL-C水平升高，导致AS形成〔4，5〕。另外，PCSK9还可能通过对细胞膜表面受体CD36的表达方式进行调节，从而干预AS发生、发展〔6〕。目前基于血脂异常所致AS的作用机制而研发的靶向治疗药物PCSK9抑制剂alirocumab(Praluent，Sanofi-Aventis & Regeneron)和evolocumab(Repatha，Amgen Inc)已通过临床研究并于国外上市，在服用高剂量他汀类药物仍然无法使血脂达标的患者临床治疗中取得良好的效果〔7〕。并且，与单独使用他汀类药物治疗进行比较，联合使用PCSK9抑制剂与他汀类药物对患者进行治疗，可以减轻冠状动脉钙化的形成〔8〕。这一新型药物的使用，揭开了PCSK9基因与CHD的相关研究。

根据NCBI数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ nuccore/NG_009061.1)资料显示PCSK9基因共含有12个外显子，其中第1外显子翻译的氨基酸包含信号肽和部分前片段，对蛋白质的成熟具有重要的作用〔9〕。研究结果表明PCSK9基因编码的蛋白可以通过介导血脂调节、炎症反应和细胞生物学功能等环节参与CHD的发生发展过程，而PCSK9基因突变则可能通过改变其编码蛋白合成、成熟和分泌过程，或者改变编码蛋白的功能介导CHD发病。目前国外文献报道已发现PCSK9基因第1外显子上存在V4I、21-22ins、E32K和AV53等突变位点〔10，11〕。本试验在黑龙江省东部地区汉族人群的基因筛查中共发现c.121C>G、c.299C>T、c.427-428insGCT、A53V、P56S和c.556A>G 6个突变位点，其中c.121C>G、c.299C>T和c.556A>G突变位点在国内外研究中尚未见相关报道，目前尚不明确其突变后对编码蛋白及CHD的影响。此外，本试验还发现国外文献已报道的框移突变位点c.427-428insGCT和错义突变A53V和P56S，但未发现V4I、21-22ins、E32K突变位点，推测可能是由于这些突变位点在该人群中突变频率极低所致。

在Gutierrez-Cirlos等〔10〕和Ohta等〔11〕的研究中发现PCSK9基因A53V位点与家族性高胆固醇血症有关，然而在我国首次发现PCSK9基因A53V多态性位点的家族性高胆固醇血症患者当中未发现该多态性基因位点与家族性高胆固醇血症有关，推测这可能是由于PCSK9基因对家族性高胆固醇血症的影响受其他因素的调控〔12〕。此外，Miyake等〔13〕发现A53V在高LDL-C和低LDL-C人群中均有分布，且该多态性位点的突变可以影响其编码蛋白折叠和分泌从而影响LDL-C水平〔14〕，这一结论与Mayne等〔15〕的研究结果一致。本研究与上述研究结果相同，表明PCSK9基因A53V位点突变与CHD患者脂代谢异常相关。

综上，PCSK9是研究心血管疾病的一个重要基因，对于进一步了解疾病的遗传规律，筛选易感人群进行疾病的预防治疗具有重要意义。随着遗传分子学技术的快速发展，对于PCSK9基因组学的研究将不断深入，有望发现更多与CHD相关的多态性位点，并进一步研究作用机制，从而打开基因靶向药物治疗的大门，开创CHD个体化治疗的新时代。