银杏黄酮、银杏内酯及联合应用对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响

郭 莹，张则一，周展羽

（浙江中医药大学，浙江 杭州 310053）

银杏叶为银杏科植物银杏Ginkgo bilobaL.的干燥叶，主产于我国，用于瘀血阻络、胸痹心痛、中风偏瘫等证。已制成银杏叶提取物（Ginkgo bilobaextract，EGB）［1］，并以银杏叶片、注射剂等多种制剂形式用于临床，在治疗心脑血管疾病等方面发挥了很好的疗效。银杏叶提取物主要由黄酮和萜内酯类化合物组成［2-4］，黄酮和萜内酯均对心脑血管疾病有一定的保护作用，两者在EGB 中是否协同起效是探究的关键问题。

前期体外抗氧化实验研究表明，银杏黄酮和银杏内酯具有一定的协同作用，两者配比为4∶1 时作用最强，和银杏叶片及药典对银杏叶提取物所规定的比例相吻合［1］，也和文献报道相一致［5］。本研究是在前期实验的基础上，进一步探讨银杏黄酮、银杏内酯及联合应用（相当于银杏叶片或银杏叶提取物）对脑缺血再灌注损伤的保护作用，阐明银杏叶提取物多组分（黄酮和内酯）配伍的合理性。

1 材料和仪器

1.1 动物 健康清洁级SD 大鼠，雄性，体质量（280±20）g，购自浙江中医药大学动物实验研究中心，实验动物生产许可证号SCXK（沪）2013-0016。

1.2 试剂与药物 银杏黄酮（南京世州生物科技有限公司，批号20160315YXHT，质量分数≥85%）；银杏内脂（南京世州生物科技有限公司，批号20160308YXNZ，质量分数≥90%）；尼莫地平片（正大青春宝药业有限公司，批号1511013）；水合氯醛（分析纯，阿拉丁试剂有限公司，批号 20160215）；超氧化 物歧化 酶（SOD，批 号20160628）、丙二醛（MDA，批号20160629）、白细胞介素-1β（IL-1β，批号20160625）、白细胞介素-6（IL-6，批号20160628）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α，批号20160627）、蛋白定量检测试剂盒（批号20160625）购自南京建成生物工程研究所；TTC 染色试剂盒（美国Sigma 公司，批号BCBR5462）；双蒸水为实验室自制。

1.3 仪器 BS323S 电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；318C+酶标仪（上海沛欧分析仪器有限公司）。

2 方法

2.1 构建动物MCAO 模型 采用线栓法造模，首先用10%水合氯醛溶液麻醉大鼠，术区常规剃毛消毒，将颈部正中右旁侧切开，逐层分离，暴露右侧颈总动脉，挂线备用。随后于颈外和颈内动脉挂线，分离露出颈外动脉主干，在其根部打结。用动脉夹夹闭颈内动脉和颈总动脉近心端。在颈总动脉近头端距分叉部5 mm 左右斜剪一小口，导入线栓进入颈内动脉。移除颈内动脉上的动脉夹，将线栓插至所需深度，遇阻力即停。结扎切口处颈总动脉挂线，移开颈总动脉上的血管夹。确认无出血后计时，缺血1 h 后拔除线栓形成再灌注［6-7］。

2.2 分组与给药 将SD 大鼠随机分为银杏内酯组、银杏黄酮组、联合给药组、尼莫地平组、模型组、假手术组，每组8 只。再灌注同时，灌胃给予银杏黄酮组银杏黄酮6 mg/kg，银杏内酯组给予银杏内酯6 mg/kg，联合用药组给予银杏黄酮4.8 mg/kg 及银杏内酯1.2 mg/kg，尼莫地平组给予尼莫地平6.25 mg/kg，模型组与假手术组灌胃等量生理盐水，连续给药7 d，饲养期间内各组大鼠自由饮水进食。

2.3 神经功能评分 采用longa 评分［8］法进行评分，1～4分为造模成功。0 分，无任何神经功能缺损的症状，活动正常；1 分，轻微神经功能缺损，对侧前肢保持屈曲状态；2 分，中度神经功能缺损，向对侧爬行转圈；3 分，重度神经功能缺损，向偏瘫侧身体倾倒；4 分，无法自主行走，意识丧失；5 分，死亡。

2.4 TTC 染色测定脑梗死比 将大鼠断头取脑，用生理盐水漂洗，随后置于冰箱冷冻层冷冻20 min，去除嗅脑、小脑和脑干，作冠状切片，共6 片。37 ℃条件下0.5% TTC溶液孵育10 min，用滤纸吸干表面，拍照，采用Image pro plus 软件分别计算出全脑面积和梗死面积，计算脑梗死面积百分比［8］。脑梗死面积百分比=（梗死面积/全脑面积）×100%。

2.5 脑组织中脑缺血相关指标测定 取右脑称定质量后置于冰水浴的研钵内，加入4 ℃生理盐水100 μL 碾磨，碾磨过程中持续加入低温生理盐水，加入总量为脑组织质量的9 倍量。3 000 r/min 离心15 min，取上清得10% 脑匀浆，上清稀释10 倍后，可得1%脑匀浆。按照试剂盒说明测定MDA、TNF-α、IL-6、IL-1β、SOD 水平。

3 结果

3.1 各实验组大鼠一周体质量变化 各实验组大鼠连续7 d的体质量变化见图1。与假手术组相比，模型组大鼠体质量下降，且体质量恢复缓慢，差异无统计学意义；与模型组相比，各给药组均有体质量先减轻后升高的趋势，差异无统计学意义。

图1 各实验组大鼠一周体质量变化

3.2 神经功能评分 根据longa 评分法进行评分，见表1。假手术组大鼠表现无异常症状；与模型组比较，随着时间推移，各给药组评分有下降趋势，表明神经功能得到逐步恢复。除尼莫地平组外，其他3 组虽有下降趋势，但无显著性差异，可能和神经功能变化相对于其他指标变化略为滞后有关。

表1 各实验组大鼠一周神经功能评分一览表（，n＝6）

表1 各实验组大鼠一周神经功能评分一览表（，n＝6）

注：与假手术组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05。

3.3 TTC 染色测定脑梗死面积百分比 按“2.4”项下方法制作大鼠脑冠状切片，选取第3 片测量脑梗死比，结果见图2、表2。假手术组无梗死，模型组脑梗死面积百分比增加（P＜0.01）；与模型组相比，各给药组脑梗死百分比降低（P＜0.01），其中尼莫地平组脑梗死百分比最小，联合给药组优于银杏黄酮组（P＜0.05）。

图2 各组大鼠脑冠状切片对比

表2 各组大鼠大脑切片脑梗死比结果（，n＝6）

表2 各组大鼠大脑切片脑梗死比结果（，n＝6）

注：与假手术组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；与银杏黄酮组比较，△P＜0.05。

3.4 脑组织中脑缺血相关指标检测结果

3.4.1 各组大鼠脑组织中TNF-α 水平 由图3 可知，与假手术组相比，模型组大鼠脑组织中TNF-α 水平增加（P＜0.01），表明造模成功；与模型组比较，银杏内酯组TNF-α 水平减少（P＜0.05），银杏黄酮组、联合用药组和尼莫地平组TNF-α 水平减少（P＜0.01）。

图3 各组大鼠脑组织中TNF-α 水平（n＝6）

3.4.2 大鼠脑组织中MDA 水平 由图4 可知，与假手术组相比，模型组大鼠脑组织中MDA 水平增加（P＜0.01）；与模型组相比，各给药组大鼠脑组织中MDA 水平降低（P＜0.01）；联合用药组优于银杏内酯组和银杏黄酮组（P＜0.01）。

图4 各组大鼠脑组织中MDA 水平（n＝6）

3.4.3 大鼠脑组织中白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）水平 由图5 可知，与假手术组相比，模型组大鼠脑组织中IL-1β 和IL-6 水平增加（P＜0.01）；与模型组相比，各给药组大鼠脑组织中IL-1β 和IL-6 水平降低（P＜0.01），联合用药组IL-1β 水平的降低明显优于银杏黄酮组（P＜0.01）。

图5 各组大鼠脑组织中IL 水平（n＝6）

3.4.4 大鼠脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）水平 大鼠脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）检测结果如图6 所示。与假手术组相比，模型组大鼠脑组织CuZn-SOD、T-SOD 水平降低（P＜0.01）；与模型组相比，银杏内酯组和银杏黄酮组大鼠脑组织T-SOD 水平升高（P＜0.05），联合用药组和尼莫地平组大鼠脑组织CuZn-SOD、T-SOD 水平升高（P＜0.01）；联合用药组在升高大鼠脑组织CuZn-SOD 水平优于银杏内酯组（P＜0.05）。

图6 各组大鼠脑组织中CuZn-SOD 和T-SOD 水平（n＝6）

4 讨论

脑缺血再灌注发生时，机体内通过多途径激发产生的大量自由基成为加重脑损伤的重要因素，并可通过引发脂质过氧化连锁反应使损伤进一步加重。SOD 为机体十分重要的自由基清除剂，过多的氧自由基将消耗大量的SOD，降低其活性［9］。大量的活性氧（ROS）能攻击生物膜中的不饱和脂肪酸，导致产生大量的脂质过氧化产物MDA，从而损伤组织DNA［10-12］。银杏黄酮、银杏内酯以及联合用药均可显著降低大鼠脑组织中MDA 水平，联合用药显著优于单用；三者可不同程度显著升高T-SOD 水平，联合用药还可显著升高CuZn-SOD 活力，效果显著优于银杏内酯组。表明银杏黄酮及银杏内酯对氧自由基有一定清除作用，减少氧自由基对脑细胞损伤，两者联合应用可更好地发挥清除自由基和保护脑缺血再灌注损伤的作用。

TNF-α、IL-1β 和IL-6 为3 种炎症细胞因子，其中IL-1β 在正常脑组织中低表达，而在脑缺血再灌注损伤发生后分泌增多，刺激单核-巨噬细胞产生TNF-α 和IL-6 等细胞因子，进一步加重局部炎症反应［13］，破坏血脑屏障。脑缺血再灌注损伤发生后，TNF-α 表达迅速增加，并与其受体结合，引发级联反应，影响细胞程序性死亡和非程序性死亡。在急性炎症发生时，IL-6 能促进急性期蛋白的合成，并促进TNF-α 和IL-1 所诱导的恶病质［14］。银杏黄酮、银杏内酯以及联合用药均可不同程度显著降低大鼠脑组织中IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平，联合用药降低IL-1β 水平的效果明显优于银杏黄酮单用（P＜0.01）。说明三者均可通过抑制炎症反应修复脑缺血再灌注损伤，两者合用对IL-1β 的抑制作用显著优于银杏黄酮单用。

前期实验研究表明，银杏黄酮和银杏内酯可在体外抗氧化实验中发挥良好的协同作用，两者质量比为4∶1 时协同作用最佳，和文献报道［5］相吻合。本研究在前期实验的基础上，在大鼠脑缺血再灌注损伤模型上进一步探究两者的协同作用。综上可知，银杏黄酮和银杏内酯可通过清除自由基、抑制炎症反应等改善大鼠脑缺血再灌注损伤，两者合用可协同起效，尤其在降低MDA 水平（优于银杏黄酮和银杏内酯）、升高CuZn-SOD 水平（优于银杏内酯）、降低IL-1β 水平（优于银杏黄酮）、降低脑梗死百分比（优于银杏黄酮）方面协同作用显著。两者协同起效的机制是否通过相互促进体内吸收和分布，或是通过多组分多靶点是否发挥协同作用，或是通过其他机制形成合力，这将在后续实验研究中做进一步探究。