HPLC 法测定丁朴凝胶贴膏中3 种成分

2020-05-12王奕博杜媛媛于颖超曲昌海尹兴斌董晓旭孙毅坤

中成药 2020年2期

王奕博，杜媛媛，于颖超，曲昌海，尹兴斌，董晓旭，孙毅坤，倪健

（1.北京中医药大学中药学院，北京 102488；2.北京中医药大学中医药研究院，北京 100029）

丁朴凝胶贴膏是以北京中医药大学东方医院临床经验方——“胃瘫外敷方”为基础，原剂型为中药细粉与蜂蜜等黏合剂混合成外敷制剂，现将其改为凝胶贴膏剂。该方临床应用多年，尤其对寒症型术后胃瘫患者效果显著［1-2］，它由丁香、姜厚朴、肉桂等中药组成，所含丁香酚、和厚朴酚、厚朴酚等成分具有促进胃肠蠕动、保护胃黏膜、增强胃动力的作用［3-7］。本实验建立HPLC 法测定这3 种成分的含有量。

凝胶贴膏性质黏稠，而且部分高分子材料不溶于有机试剂，不同方法对其提取率有较大影响。目前，相关提取方法包括冷浸法、超声法、分散后再处理法［8-11］，但鲜有对其所得提取率进行比较，故本实验又考察了超声时间、冷浸时间、溶剂量、是否分散对丁朴凝胶贴膏提取率的影响，以期为后续研究提供借鉴。

1 材料

1.1 仪器 LC-20AT 型高效液相色谱仪（配置SPD-M20A PDA 检测器，日本岛津公司）；UltiMate 3000 型高效液相色谱仪［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；TLE204102型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ3200DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；JY5002 型电子天平（上海衡平仪器仪表厂）。

1.2 试剂与药物桂皮醛（批号110710-201720，质量分数98.7%）、丁香酚（批号110725-201716，质量分数99.6%）、和厚朴酚（批号110730-201614，质量分数99.3%）、厚朴酚（批号 110729-201714，质量分数100.0%）对照品均购自中国食品药品检定研究院。凝胶贴膏及缺肉桂、丁香、厚朴阴性贴膏均为自制。硅藻土（天津市福晨化学试剂厂，批号20180320）。甲醇为色谱纯（美国Fisher 公司）或分析纯（北京化工厂）；水为纯净水（娃哈哈集团有限公司）。

2 方法与结果

2.1 凝胶贴膏制备取处方量聚丙烯酸钠、氢氧化铝，混合均匀后加入甘油、中药挥发油搅拌均匀，作为油相；取处方量酒石酸、纯净水、厚朴流浸膏搅拌均匀，作为水相；将水相均匀加到油相中，以60 r/min 左右转速搅拌成型后置于无纺布上，将膏体均匀涂布于自制涂布框内，加盖压花膜，室温静置，即得（生药量15 g/贴）。

2.2 指标成分含有量测定

2.2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇-水，梯度洗脱，程序见表1；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长290 nm；进样量10 μL。

2.2.2 供试品溶液制备取自制凝胶贴膏，揭下压花膜，不锈钢勺刮取0.5 g 置于蒸发皿中，精密称定质量，加入等量硅藻土，以钢勺不断挤压搅拌至硅藻土与凝胶贴膏完全混匀，具体表现为贴膏外观类似絮状且黏性消失，即为分散完成。将其置于具塞锥形瓶中，精密加入50 mL甲醇，称定质量，超声（100 W、40 kHz）10 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

表1 梯度洗脱程序

2.2.3 对照品溶液制备精密称取桂皮醛、丁香酚、和厚朴酚、厚朴酚对照品适量，加甲醇制成每1 mL 分别含四者0.107 24、1.073、0.158 6、0.334 mg，摇匀，即得。

2.2.4 阴性样品溶液制备取等量缺肉桂、缺丁香、缺厚朴阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.2.5 专属性试验精密吸取供试品、对照品、阴性样品溶液各10 μL，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1，可知阴性无干扰，方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图

2.2.6 线性关系考察精密吸取对照品溶液0.1、1.0、2.0、3.0、6.0 mL 置于10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定。以峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X）进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系

2.2.7 精密度试验精密吸取对照品溶液10 μL，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得桂皮醛、丁香酚、和厚朴酚、厚朴酚峰面积RSD 分别为0.44%、0.50%、0.56%、0.38%，表明仪器精密度良好。

2.2.8 重复性试验称取凝胶贴膏约0.5 g，共6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得桂皮醛、丁香酚、和厚朴酚、厚朴酚含有量RSD 分别为2.78%、2.73%、2.27%、1.61%，表明该方法重复性良好。

2.2.9 稳定性试验取供试品溶液，于0、1、3、6、12、24 h 在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得桂皮醛、丁香酚、和厚朴酚、厚朴酚峰面积RSD 分别为2.59%、0.48%、1.42%、1.20%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.2.10 加样回收率试验精密称取同一批含有量已知的凝胶贴膏0.5 g，共6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，加入对照品溶液后在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，桂皮醛平均加样回收率为92.03%，RSD 为4.14%；丁香酚平均加样回收率为98.03%，RSD 为1.56%；和厚朴酚平均加样回收率为98.31%，RSD 为2.10%；厚朴酚平均加样回收率为99.06%，RSD 为1.32%。

2.3 提取方式考察

2.3.1 凝胶贴膏制备取适量丁香、肉桂混合挥发油及厚朴流浸膏，加入处方量辅料，即得（每1 g 含丁香酚7.69 mg、桂皮醛1.28 mg、和厚朴酚1.05 mg、厚朴酚2.03 mg）。

2.3.2 正交试验取0.5 g 凝胶贴膏，分别加入规定量硅藻土分散或不分散，并加50 mL 甲醇超声或冷浸规定时间，以丁香酚、厚朴酚、和厚朴酚平均提取率为评价指标，考察硅藻土分散比（A）、超声时间（B）、冷浸时间（C）对其的影响，因素水平见表3，结果见表4。由此可知，除A1B1C1外，各组合所得提取率相差不大，推测这3 个因素之间可能存在相互作用，故对其进行单因素试验考察。

表3 因素水平

表4 试验设计与结果

2.3.3 料液比、冷浸时间取凝胶贴膏0.5、1、2 g，加50 mL 甲醇（即料液比1∶100、1∶50、1∶25）冷浸后，于10、20、30、60、120、180、240、360、480、600、720、1 440 min 各取样1 mL，甲醇补足减失的质量，计算提取率，平行3 次，取平均值，结果见图2。由此可知，料液比1∶100、冷浸时间2 h 时可得到90%以上的提取率。

图2 不同料液比下冷浸时间对提取率的影响

2.3.4 不分散后超声时间取凝胶贴膏0.5 g，加50 mL甲醇超声后，于10、20、30、40 min 各取样1 mL，甲醇补足减失的质量，计算提取率，平行5 次，取平均值，结果见图3。由此可知，提取40 min 时提取率仍不能达到90%，而且不同提取时间之间差异较大。

图3 不分散后超声时间对提取率的影响

2.3.5 分散后超声时间取凝胶贴膏0.5 g，加等量硅藻土分散，加50 mL 甲醇超声后于10、20、30、40 min 各取样1 mL，甲醇补足减失的质量，计算提取率，平行5 次，取平均值，结果见图4。由此可知，提取10 min 时提取率即可达90%以上，而且不同提取时间之间差异较小，故确定最优提取方法为加1 倍量硅藻土分散后超声10 min。

图4 分散后超声时间对提取率的影响

2.3.6 样品含有量测定制备3 批样品，按上述方法进行测定，每批3 次。结果，丁香酚、和厚朴酚、厚朴酚平均含有量分别为7.54、1.00、1.79 mg/g。

3 讨论

本实验对丁朴凝胶贴膏中桂皮醛也进行了分析，发现在贴膏制备过程中其失达40%，即使保证避光条件其平均加样回收率亦仅为92.03%。桂皮醛在甲醇中的稳定性较差，而且样品分散可能导致其损失，故在提取含该成分的凝胶贴膏时应避免使用硅藻土，同时提取溶液可选择乙腈［12-13］。

考察冷浸时间时发现，取样量0.5、1、2 g 条件下所得提取率大致相同，而贴膏体积越大，所需冷浸时间越长。然后，对三者对未达到稳态部分的释放曲线进行拟合，发现均符合一级动力学方程（r分别为0.970 0、0.990 3、0.991 4），表明凝胶贴膏在有机试剂中并不会产生溶蚀作用，仅是类似于一种固体［14］，成分由内而外被动扩散，进而解释了不分散时为何需要长时间超声才能达到90%以上提取率。

考察检测波长时发现，290 nm 下桂皮醛、丁香酚、和厚朴酚、厚朴酚峰面积大小适中，故确定其作为检测波长。

不使用硅藻土分散冷浸2 h 以上后，可充分提取0.5 g小块凝胶贴膏，并且贴膏体积越大，所需冷浸时间越长，虽然超声提取有助于指标成分溶出，但也需要长时间才能达到90%以上提取率，同时RSD 也较大，其原因可能是不分散时凝胶贴膏性质黏稠，取样表面积差异较大，导致扩散速度不同，从而放大误差；使用硅藻土分散后超声10、40 min 时，所得提取率基本接近，RSD 较小，为了节约时间、降低误差，本实验选择分散后超声提取10 min。