紫苏叶提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用

王亚楠，张志军，李会珍

（中北大学化学工程与技术学院，山西 太原 030051）

高尿酸血症是由遗传或后天因素引起的嘌呤代谢性疾病［1］，已被定为心血管疾病的危险因子［2］。高浓度血清尿酸对肾有直接伤害，可导致肾纤维化、肾衰竭，也可诱发高血压。高尿酸血症是引发痛风的重要生化基础［3］。当高尿酸血症患者体内的尿酸以钠盐的形式沉积在关节、软组织处，就会引起组织炎症进而导致痛风［4］。黄嘌呤氧化酶（XOD）是有效治疗高尿酸血症的重要靶点［5］，能催化次黄嘌呤生成黄嘌呤，再进一步生成尿酸和自由基［6］，抑制其活性可以阻止黄嘌呤向尿酸转化，降低体内尿酸的含有量［7］，达到治疗高尿酸血症的目的。目前，临床上治疗高尿酸血症和痛风的药物主要包括别嘌呤醇、奥昔嘌呤、非布司他、托匹司他、丙磺舒、苯溴马隆等［8］，但均对人体有严重伤害，如常用药物别嘌呤醇疗效确切，但不良反应也十分明显，容易引起头痛、恶心、白细胞异常等。因此，从天然植物中筛选高效、低不良反应的黄嘌呤氧化酶抑制剂具有良好的应用前景。

紫苏Perilla frutescens（L.）Britt.属一年生草本植物，是卫生部首批颁布药食两用的中药之一［9］。紫苏叶既可鲜食，也可用于治疗多种疾病，如镇咳［10］、健胃、降血脂血压［11］、增强记忆力［12-13］、解表散 寒［14］、抑 菌［15-16］等。Kaufmann 等［17］研究表明，紫苏提取物在体外可抑制黄嘌呤氧化酶的活性，其中主要有效成分为野黄芩素-7-O-二葡萄糖苷、木犀草素-7-O-二葡萄糖苷、芹菜素-7-O-二葡萄糖苷等黄酮苷；Wang 等［18］采用超滤结合高效液相色谱法，鉴定出紫苏提取物中山奈酚-3-O-芸香苷、迷迭香酸、甲基迷迭香酸、芹菜素和4′，5，7-三甲氧基黄酮为有效的黄嘌呤氧化酶抑制剂；霍立娜［19］采用高速逆流色谱技术，从紫苏叶70%乙醇提取物中得到3 种高纯度的黄嘌呤氧化酶抑制剂化合物，即野黄芩素、木犀草素和芹菜素；肖小年等［20］研究表明，紫苏子油对黄嘌呤氧化酶也有抑制作用。现阶段，针对紫苏叶提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用动力学尚未有深入详细的研究和报道，故本实验对此进行研究。

1 材料

1.1 试剂与药物 紫苏叶采自课题组专用品种，经中北大学张志军老师鉴定为正品，开花前收获，自然晾干，去杂，粉碎过80 目筛，密封袋保存备用。黄嘌呤（批号D1828210）、别嘌呤醇（批号C1805121）购于上海阿拉丁生化科技有限公司；黄嘌呤氧化酶（批号611L011）购于北京索莱宝科技有限公司；其他试剂为分析纯，均购于天津市恒兴化学试剂制造有限公司。

1.2 仪器 SB-5200 DTDN 超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；TDL-5-A 台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；RE-5210A 旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；FD-1A-50 冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；AR1530 精密电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；UV-8000S 紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司）。

2 方法

2.1 紫苏叶提取物制备 精密称取紫苏叶粉末50 g，加入1 000 mL 50%乙醇。浸泡2 h，超声提取，功率200 W，时间1 h，温度50 ℃。将上清液滤出，相同条件下将滤渣再提取2 次，合并滤液，离心除去残渣，所得上清液用旋转蒸发仪减压浓缩，冷冻干燥，备用。在该提取条件下，紫苏叶提取物的得率为31.3%。

2.2 酶活力测定 紫苏叶提取物对黄嘌呤氧化酶活力测定方法参照文献［21-22］加以改进。将pH=7.5 磷酸缓冲液2.5 mL 置于试管中，加入0.6 mmol/L 黄嘌呤溶液2 mL，25 ℃水浴20 min，加入25 ℃预温的0.05 U/mL 酶溶液0.5 mL，充分混匀，紫外分光光度计全波长扫描，确定反应产物尿酸的特征吸收峰。采用相同的反应体系，从黄嘌呤氧化酶加入时开始计时，测定在特征吸收峰下一定时间内吸光度变化，即尿酸生成量，系统自动每1 s 测定1 次，连续5 min，每个样品平行操作3 次，计算平均值。以反应时间为横坐标，吸光度值为纵坐标作图，直线斜率表示反应速率（dA/min），斜率越大，说明酶活力越强，以每分钟特征峰处吸光度值的增加来定义酶活力（dA/min），dA为吸光度的增加值。

2.3 紫苏叶提取物对黄嘌呤氧化酶抑制作用的测定 5 mL酶促反应体系中依次加入 pH=7.5 磷酸缓冲液、0.6 mmol/L黄嘌呤溶液、紫苏叶提取物、0.05 U/mL 酶溶液，充分混匀，具体加样量见表1。

表1 反应体系

按“2.2”项下方法，测定一定时间内产物尿酸的吸光度，以反应时间为横坐标，吸光度为纵坐标作图，通过其斜率计算酶活力。加入紫苏叶提取物时，酶活力表示为A；无紫苏叶提取物加入时，酶活力表示为B，紫苏叶提取物对黄嘌呤氧化酶的相对抑制率=（1-A/B）×100%。以空白组调零，测定样品组A；以阴性对照组调零，测定阳性对照组B。

2.4 不同浓度紫苏叶提取物对酶的抑制作用 按“2.2”项下方法，测定1、2、3、4、5、6、7 mg/mL 紫苏叶提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制率，将紫苏叶提取物浓度与抑制率进行回归，得到回归方程，再根据回归方程计算半数抑制浓度（IC50）。在酶促反应体系中，固定黄嘌呤溶液浓度（0.6 mmol/L）不 变，加入不同质量 浓度紫 苏提取 物（1.0、3.0、5.0 mg/mL），测定在 不同浓 度酶溶 液（0.025、0.05、0.10、0.15 U/mL）对酶活力的影响，即对反应速率的影响。以酶浓度为横坐标，反应速率为纵坐标作图，通过得到的相关曲线即可判断紫苏叶提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制是否为可逆抑制。

2.5 紫苏叶提取物对黄嘌呤氧化酶抑制动力学及抑制常数的测定 保持酶促反应体系5 mL，首先固定酶浓度不变（0.05 U/mL），依次改变底物黄嘌呤溶液浓度（1.2、0.6、0.3、0.15 mmol/L），测定不同质量浓度提取物（1.0、3.0、5.0 mg/mL）对酶活力的影响，即对反应速率的影响。采用双倒数作图法（Lineweaver-Burk），以底物黄嘌呤溶液浓度的倒数1/ ［S］为横坐标，以反应速率的倒数1/V为纵坐标作图，判断提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制类型。再根据其抑制类型运用Dixon 作图法计算抑制动力学常数Ki。

3 结果

3.1 特征吸收峰的测定 按“2.2”项下方法，在反应体系中依次加入各反应物进行反应，对其产物进行全波长扫描，结果见图1，可知酶反应产物尿酸在294 nm 处有最大吸收峰。

图1 反应产物紫外吸收光谱图

3.2 紫苏叶提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制率 以紫苏叶提取物浓度为自变量，抑制率为因变量作图，见图2。由此可知，随着紫苏叶提取物质量浓度增大抑制率不断增强，说明提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制是呈剂量依赖；在0～1 mg/mL时，抑制率随着提取物质量浓度升高呈线性增长；在1～5 mg/mL 时，随着提取物质量浓度增加抑制率增强，但增长趋势较小；大于5 mg/mL时，抑制率趋于恒定。因此，本实验选择紫苏叶提取物质量浓度为5 mg/mL。利用SPSS 软件对试验数据进行回归分析，得出紫苏叶提取物对黄嘌呤氧化酶的IC50为5.80 mg/mL。

图2 紫苏叶提取物质量浓度对XOD 抑制率的影响

3.3 紫苏叶提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用 在反应体系中，保持底物黄嘌呤溶液质量浓度不变，分别测定1、3、5 mg/mL紫苏叶提取物在不同酶浓度体系中的反应速率，以黄嘌呤氧化酶浓度为横坐标，反应速率为纵坐标作图。如图3 所示，图中直线基本经过原点，且随着提取物质量浓度的增大，反应速率随之减小，表明紫苏叶提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用是可逆抑制。

3.4 紫苏叶提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制动力学分析

3.4.1 紫苏叶提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制类型 在反应体系中，保持黄嘌呤氧化酶浓度不变，分别测定1、3、5 mg/mL紫苏叶提取物在不同黄嘌呤溶液浓度体系中的反应速率。用双倒数作图法作图，以底物浓度的倒数［1/S］为横坐标，反应速率的倒数［1/V］为纵坐标作图，得到一组直线，见图4。由此可知，所有直线相交于纵轴上的一点，且纵轴的截距不随提取物浓度的不同而改变，这些特点符合竞争性抑制。因此，紫苏叶提取物对黄嘌呤氧化酶的抑制类型属于竞争性可逆抑制。

图3 紫苏叶提取物对XOD 的抑制作用

图4 紫苏叶提取物对XOD 的抑制类型的影响

3.4.2Ki计算 采用Dixon 作图法求Ki。对黄嘌呤溶液浓度0.15、0.30 mmol/L 两个反应体系进行测定，以紫苏叶提取物质量浓度为自变量，反应速率的倒数为因变量作图。图中直线相交于一点，计算出该点即可得Ki。如图5 所示，紫苏叶提取物对黄嘌呤氧化酶的Ki为2.19 mg/mL。

图5 紫苏提取物对XOD 抑制常数的影响

4 讨论

本实验采用超声辅助提取法从紫苏叶中提取出黄嘌呤氧化酶抑制剂，利用紫外分光光度法对其进行检测，证明了确有该类成分，抑制作用为可逆的竞争性抑制，与别嘌呤醇相同。基于此，在临床上治疗高尿酸血症及痛风时可以适量加入紫苏叶中提取的黄嘌呤氧化酶抑制剂以减少别嘌呤醇的使用剂量，从而降低后者对患者的毒副作用。

此外，进一步研究了对黄嘌呤氧化酶的抑制作用及抑制动力学，得出抑制剂对黄嘌呤氧化酶的 IC50为5.80 mg/mL，抑制动力学常数Ki为2.19 mg/mL。紫苏叶提取物作为黄嘌呤氧化酶抑制剂，最大优势是无副作用、来源广泛，可作为一种治疗高尿酸血症及痛风低毒、价廉的潜在药物，同时也可开发相关的保健品，应用前景广阔。本研究为紫苏资源开发、寻求治疗高尿酸血症和痛风新型药物提供了参考依据，但其工业化提取、纯化技术和临床试验仍需要作深入系统研究。