一测多评法同时测定艾纳香油中5 种成分

秦晋颖，谢晓林，赵 元，张新凤，吴 倩，王昌胜，刘志刚∗

（1.贵阳学院食品与制药工程学院，贵州 贵阳 550005；2.贵州黄果树立爽药业有限公司，贵州 贵阳 550004）

艾纳香油为菊科植物艾纳香Blumea balsamifera（L.）DC.叶中分离而得的油，是我国西南少数民族习用药物［1］。L-龙脑为艾纳香油中主要活性成分，此外还含有β-石竹烯、樟脑、β-蒎烯和芳樟醇等成分［2-3］，具有镇痛、抗菌和消炎的药理活性，是多种贵州民族药成方制剂的组方药物［4-10］。艾纳香药材来源较复杂，伪品较多，目前艾纳香油的压榨工艺并不统一，现有地方标准采用恒温GC外标法对龙脑含有量进行定量测定，色谱分离效果差，且樟脑和β-蒎烯等有效成分的含有量没有得到控制，单一成分含有量测定已难以全面反映艾纳香油的质量，多指标定量测定已成为中药质量控制的发展趋势［11］。传统的多指标定量测定存在着对照品消耗量大、操作复杂和容易导致误差等缺陷，一测多评法已被用于中药化学成分的含有量测定［12-18］，2015 年版《中国药典》 一部收载黄连药材中巴马汀、小檗碱、表小檗碱和黄连碱4 种主要成分的含有量采用一测多评法测定。本研究建立一测多评法测定艾纳香油中的5 种成分含有量，并与传统内标法测定结果比较，以期为全面提升艾纳香油的质量标准奠定基础，并为相关制剂的质量控制提供参考。

1 材料

岛津GC-2014 型气相色谱仪（配Aoc-20i+s 自动进样器）、LAB Solution 色谱工作站（日本岛津公司）；KQ5200DB 型数控超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）；FA124 型电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）。

β-蒎烯（批号111827-201508）、樟脑（批号110747-201609）、龙脑（批号110881-201311）对照品均购自中国食品药品检定研究院，纯度均大于98.0%；β-石竹烯（批号181020）和α-石竹烯（批号180926）对照品购自北京世纪奥科生物技术有限公司，纯度均大于96.0%。高纯氮气、氢气和干燥空气体积分数均为99.999%（贵州特建气体有限公司）；其他试剂均为分析纯。

实验用8 批艾纳香药材于2017 年10 月采自贵州省罗甸县，经贵阳中医学院周汉华教授鉴定为菊科植物艾纳香Blumea balsamifera（L.）DC.的叶，其粗升华物经过压榨分离而得到艾纳香油样品。

2 方法与结果

2.1 一测多评法建立

2.1.1 色谱条件 色谱柱采用PEG-20 M 交联毛细管柱（30 m×0.32 mm，1.0 μm）；载气采用氮气；分流进样模式；分流比10∶1；程序升温（起始温度70 ℃，维持2 min，以5 ℃/min 速率升温至150 ℃，维持2 min）；进样口温度240 ℃；采用FID 检测器，温度240 ℃；进样量1.0 μL。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.2 对照品贮备液制备 分别取β-蒎烯、β-石竹烯、樟脑、α-石竹烯和龙脑对照品适量，精密称定，用乙酸乙酯溶解，制成每1 mL 分别含上述5种成分0.372、0.556、1.62、0.912、4.10 mg 对照品贮备液。

2.1.3 内标溶液制备 取适量水杨酸甲酯，精密称定，置于100 mL 量瓶中，加乙酸乙酯稀释至刻度，配成质量浓度为15.0 mg/mL 的内标溶液，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.1.4 混合对照品溶液制备 精密量取β-蒎烯、β-石竹烯、樟脑、α-石竹烯和龙脑对照品贮备液各2.0 mL 至10 mL 量瓶中，加乙酸乙酯配制成质量浓度分别为β-蒎 烯0.074 4 mg/mL、β-石竹烯0.111 mg/mL、樟脑 0.324 mg/mL、α-石竹烯0.182 mg/mL 和龙脑0.820 mg/mL 的混合对照品溶液，经0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.1.5 供试品溶液制备 取艾纳香油样品约0.2 g，精密称定，置于100 mL 量瓶中，精密加入前述内标液1.0 mL，加乙酸乙酯定容至刻线，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.1.6 线性关系考察 精密量取“2.1.4”项下混合对照品溶液0.2、1.0、2.0、5.0、8.0 mL 分别置于10 mL 量瓶中，加入内标溶液1.0 mL，加乙酸乙酯稀释至刻度，组成系列质量浓度的混合对照品溶液。分别精密吸取各混合对照品溶液1.0 μL，在“2.1.1”项条件下进样。以对照品溶液质量浓度为横坐标（X），对照品与内标峰面积之比为纵坐标（Y），进行回归，结果见表1，表明β-蒎烯、β-石竹烯、樟脑、α-石竹烯和龙脑在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.1.7 相对校正因子测定 精密吸取上述不同质量浓度的混合对照品溶液1.0 μL，在“2.1.1”项色谱条件下进样，记录不同质量浓度对照品与内标物峰面积，以龙脑为内参物，计算β-蒎烯、β-石竹烯、樟脑、α-石竹烯的相对较正因子，测得β-蒎烯、β-石竹烯、樟脑、α-石竹烯的相对较正因子分别为0.513、0.592、0.401、0.639，RSD 分别为1.1%、1.5%、0.9%、1.6%。

2.1.8 精密度试验 取“2.1.4”项下混合对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下连续进样6次，记录峰面积，计算各化合物峰面积与内标物峰面积比值的RSD 值，测得β-蒎烯、β-石竹烯、樟脑、α-石竹烯和龙脑峰面积比值的RSD 分别为0.8%、0.9%、0.2%、0.7%、0.2%，表明该方法精密度良好。

2.1.9 重复性试验 分别称取同一批艾纳香油样品6 份（1 号样品），精密称定，按“2.1.5”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样，测定峰面积，测得β-蒎烯、β-石竹烯、樟脑、α-石竹烯和龙脑的含有量分别为13.1、16.6、71.5、26.9、232 mg/g，RSD 分别为1.3%、1.6%、0.9%、1.7%和1.0%，表明该方法重复性良好。

2.1.10 稳定性试验 取1 号艾纳香油样品，按“2.1.5”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下，分别于室温放置的0、2、4、8、12 h 进样，测定峰面积，并与内标物的峰面积作比较，测得β-蒎烯、β-石竹烯、樟脑、α-石竹烯和龙脑峰面积比值的RSD 分别为1.4%、1.1%、0.7%，1.3%、0.8%，表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.1.11 加样回收率试验 精密称取各成分含有量已知的艾纳香油样品6 份（1 号样品），每份样品分别精密加入4.0 mL 混合对照品溶液（β-蒎烯、β-石竹烯、樟脑、α-石竹烯和龙脑质量浓度分别为0.344、0.429、1.83、0.695、5.27 mg/mL），按“2.1.5”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样，计算回收率，结果见表2。

2.2 一测多评法的耐用性

2.2.1 重复性考察 精密吸取上述5 种成分混合对照品系列对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样，记录各对照品与内参物峰面积，计算各成分的相对较正因子，测得β-蒎烯、β-石竹烯、樟脑、α-石竹烯 的相对较正因子分别为0.519、0.586、0.409、0.627，RSD 分别为2.6%、3.1%、2.9%、4.1%，表明相对校正因子的重复性良好。

2.2.2 不同仪器对相对校正因子的影响 采用PEG-20M（30 m×0.32 mm，1.0 μm）石英毛细管柱，分别考察了岛津GC-2014C 气相色谱议和Agilent 6890 N 气相色谱系统对艾纳香油中几种成分相对校正因子的影响。测得β-蒎烯、β-石竹烯、樟脑和α-石竹烯相对较正因子RSD 分别为3.3%、3.8%、4.7%、3.8%，表明不同气相色谱系统对各成分相对校正因子无显著影响。

表2 各成分加样回收率试验结果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.2.3 不同色谱柱对相对校正因子的影响 采用岛津GC-2014C 气相色谱系统，分别考察了KBWax气相色谱毛细管柱（30 m×0.32 mm，1.0 μm）、中科院兰州物化所PEG-20 M（30 m×0.32 mm，1.0 μm）、大连中汇达PEG-20M（30 m×0.32 mm，1.0 μm）3 种不同色谱柱对相对校正因子的影响，测得β-蒎烯、β-石竹烯、樟脑和α-石竹烯相对较正因子的RSD 分别为3.1%、2.6%、3.3%、2.9%，表明色谱柱对各成分相对校正因子无显著影响。

2.2.4 色谱峰定位 为了能够确认β-蒎烯、β-石竹烯、樟脑和α-石竹烯色谱峰的位置，通过相对校正因子计算含有量，从而达到一测多评的目的。本实验分别考察了采用不同仪器和色谱柱时，4 种成分相对于内参物龙脑色谱峰的相对保留时间。结果表明，各成分相对保留时间在不同仪器和色谱柱条件下变化较小，结果见表3。

2.3 一测多评法与内标法结果比较 采用一测多评法对6 批艾纳香油中β-蒎烯、β-石竹烯、樟脑和α-石竹烯4 种成分进行含有量测定，结果见表4，采用SPSS 19.0 统计软件对内标法与一测多评法的2 组检测结果进行成组t检验，结果2 种方法测定结果无显著性差异，表明一测多评法可用于艾纳香油中5 种成分的含有量测定。

3 讨论

一测多评法是在多指标质量评价时，选择药材中某一廉价、易得和有效组分为内标，建立该组分与其他组分之间的相对校正因子，以计算其他组分含有量。艾纳香油中龙脑含有量最高，可获得性较好，价格适中，且稳定性较好，故选择龙脑作为内参照物，建立其与β-蒎烯、β-石竹烯、樟脑和α-石竹烯的相对校正因子，采用一测多评法同时检测艾纳香油中5 种活性成分含有量，实现了低成本对多种成分的同步测定。方法学考察结果表明，方法的重复性和准确度良好，在对照品缺乏的前提下，一测多评法可以作为一种快捷、准确的方法应用于艾纳香油的质量控制。

表3 不同仪器和色谱柱上保留时间Tab.3 Retention time on different instruments and columns

表4 各成分含有量测定结果（mg/g）Tab.4 Results of content determination of various constituents（mg/g）

在一测多评法建立的过程中，有多种因素会影响相对校正因子，本研究中考察了不同型号气相色谱仪及不同色谱柱对相对校正因子的影响，测得β-蒎烯、β-石竹烯、樟脑和α-石竹烯在各色谱条件下相对校正因子的RSD 均小于5%，并且5 种成分出峰顺序均不受色谱系统的影响，符合一测多评法建立的技术指南中的要求［10］，不同色谱仪及色谱柱对相对校正因子无显著影响。在色谱峰定位时，采用相对保留时间作为色谱峰定位参数。在不同色谱条件下，相对保留时间的重现性良好，其RSD 均小于5%，从而验证了一测多评法在艾纳香油质量控制中的可行性与技术适应性。