泡桐花中糖苷类成分及其抗氧化活性

2020-05-12冯卫生吕锦锦张靖柯张贝贝郑晓珂

中成药 2020年2期

冯卫生，吕锦锦，张靖柯，李孟，张贝贝，郑晓珂

（河南中医药大学，呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，河南郑州 450046）

泡桐花为玄参科泡桐属植物白花泡桐Paulownia fortunei（Seem.）Hemsl 的干燥花，为我国传统药材之一，具有多种药理活性，且分布广泛。泡桐花主入肺经，能疏风散热、清热解毒、清肝明目，常用于治疗上呼吸道感染、支气管肺炎、急性扁桃体炎、急性结膜炎、腮腺炎、疖肿等症。现代临床应用研究表明，泡桐具有抑菌、降血压、抗肿瘤、治疗支气管炎等作用［1-3］。本实验旨在对泡桐花进行系统的化学成分研究，以期为阐明其作用机理以及进一步地开发利用奠定基础。本实验采用50%丙酮组织破碎法提取泡桐花6.0 kg，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取。从正丁醇部位分离得到13 个糖苷类化合物，并对其进行过氧化氢诱导的NRK-52e 细胞损伤模型的干预作用进行初步研究，其中化合物2～3、6～13 对H2O2诱导的NRK-52e 细胞氧化损伤具有保护作用。

1 材料

Bruker AVANCE Ⅲ500 核磁共振仪（TMS 内标）（德国Bruker 公司）；Nicolet 10 Microscope Spectrometer（美国Thermo Scientific 公司）；LC-2000 型高压制备液相色谱仪［创新通恒（北京）科技有限公司］；UV200 型紫外检测器，YMC-Pack ODS-A 色谱柱（日本YMC 公司）；N-1100 型旋转蒸发仪、N-1111 型冷冻水循环装置、FDU-2110 型冷冻干燥机（上海爱朗仪器有限公司）；DFZ-60508 型真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；AB204-N 分析天平（万分之一，瑞士Mettler Toledo 公司）；iMARK 型酶标仪（美国BIO-RAD公司）。

柱层析填料（日本三菱化学公司）；Toyopearl HW-40（日本Tosoh 公司）；Sephadex LH-20（瑞士Parmacia Biotech 公司）；柱层析所用硅胶H（100～200 目，青岛海洋化工厂）。培养皿、E-Plate 板（ID725602，美国ACEA 公司）。NRK-52e 细胞（中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心）；DMEM 高糖培养基、胰蛋白酶（美国Gibco 公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）。H2O2溶液（天津市恒兴化学试剂制造有限公司）；水为超纯水。

泡桐花于2016 年采自药材市场，经河南中医药大学董诚明教授及谢小龙副教授鉴定为玄参科泡桐属植物泡桐Paulownia fortunei（Seem.）Hemsl 的干燥花，样品标号为201609。

2 提取与分离

干燥泡桐花6 kg，碾压粉碎，50%含水丙酮组织破碎提取3 次，提取液减压浓缩，得到泡桐花提取物总浸膏（0.74 kg）。浸膏加水溶解分散，按照极性大小依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，分别得相应部位50、220、112 g。正丁醇部位加水溶解，上大孔吸附树脂柱，依次用水，10%、20%、30%、40%、50%、70%、95% 乙醇梯度洗脱，得8 个洗脱组分，即Fr.A～H。其中组分Fr.B 经Sephadex LH-20 柱，以甲醇-水（0∶100～100∶0）梯度洗脱，得5 个亚组分Fr.B0～Fr.B4。Fr.B1 反复经过Sephadex LH-20、Toyopearl HW-40C 等凝胶柱，以甲醇-水（7∶3）洗脱，并结合半制备高效液相，乙腈-水（13∶87）洗脱，得化合物2（3.23 mg）、3（2.58 mg）。Fr.B3 按照同样的方法，半制备高效液相以乙腈-水（15∶85）洗脱，得化合物6（4.13 mg）、10（3.89 mg）、11（5.44 mg）。组分Fr.C 经过MCI Gel CHP-20 柱色谱，以甲醇-水（0∶100～100∶0）梯度洗脱，得6个亚组分Fr.C0～ Fr.C5。Fr.C1 经中压制备柱（ODS），甲醇-水（5∶95～100∶0）梯度洗脱，结合半制备液相得到化合物4（4.56 mg）、9（3.74 mg）；同法从Fr.C2，Fr.C3 分别得到化合物5（1.85 mg）、7（2.04 mg）、12（5.27 mg）。组分Fr.D 经硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇（200∶1～0∶1）梯度洗脱，得5 个亚组分Fr.D0～Fr.D4；Fr.D2 经过硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇（50∶1～0∶1）梯度洗脱，结合制备薄层得到化合物1（4.12 mg）、8（3.31 mg）；Fr.D3 经过硅胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇（20∶1）洗脱，得化合物13（3.42 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：无色针晶，易溶于甲醇、丙酮。mp 309～310 ℃，遇FeCl3-K3［Fe（CN）6］试剂显蓝色，茴香醛-浓硫酸显黄色（105 ℃），盐酸-镁粉反应呈阳性，Molish 反应呈阳性。1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：6.77（1H，s，H-3），6.44（1H，d，J=1.5 Hz，H-6），6.64（1H，s，H-8），7.87（2H，d，J=8.0 Hz，H-2′，6′），6.93（2H，d，J=8.0 Hz，H-3′，5′），5.20（1H，d，J=7.5 Hz，H-1″），5.28（1H，d，J=1.1 Hz，H-1‴），3.93/3.73（1H，m，H-6″），1.32（3H，d，J=6.2 Hz，H-6‴）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ：164.4（C-2），104.1（C-3），184.0（C-4），162.9（C-5），99.8（C-6），166.7（C-7），95.9（C-8），158.9（C-9），107.0（C-10），123.0（C-1′），129.6（C-2′，6′），117.0（C-3′，5′），100.9（C-1″），79.0（C-2″），77.7（C-3″），70.0（C-4″），76.9（C-5″），62.4（C-6″），102.5（C-1‴），72.2（C-2‴），69.9（C-3‴），73.8（C-4‴），71.3（C-5‴），18.3（C-6‴）。以上数据与文献［4］基本一致，故鉴定为apigenin-7-O-neohesperidoside。

化合物2：为白色无定型粉末，mp 197～199 ℃，ESI-MSm/z：403 ［M+H］+。1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.40（2H，d，J=7.2 Hz，H-2，6），7.33（2H，t，J=7.2 Hz，H-3，5），7.26（1H，t，J=7.2 Hz，H-4），4.83（1H，d，J=12.2 Hz，H-7），4.58（1H，d，J=12.2 Hz，H-7），4.40（2H，t，J=7.2 Hz，H-1′，1″），3.23～4.12（11H，m，sugar-H）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ：138.0（C-1），128.0（C-2，6），127.2（C-3，5），127.3（C-4），69.7（C-7），100.5（C-1′），82.4（C-2′），76.8（C-3′），69.5（C-4′），76.4（C-5′），60.9（C-6′），105.1（C-1″），74.5（C-2″），75.9（C-3″），69.7（C-4″），65.9（C-5″）。以上数据与文献［5］基本一致，故鉴定为苯甲醇O-（2′-O-β-D-吡喃木糖基）-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物3：白色粉末，易溶于丙酮、甲醇，ESI-MSm/z：511 ［M+Na］+。1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.57（1H，d，J=15.9 Hz，H-7），7.04（1H，d，J=1.7 Hz，H-2），6.96（1H，dd，J=1.7，8.1 Hz，H-6），6.77（1H，d，J=8.1 Hz，H-5），6.28（1H，d，J=15.9 Hz，H-8），5.17/5.10（1H，s，H-1″），4.54（1H，d，J=7.8 Hz，H-1′），3.33～4.30（12H，m，sugar-H），1.08（3H，d，J=6.2 Hz，H-6″）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ：127.7（C-1），114.6/114.8（C-2），149.7（C-3），146.8（C-4），116.5（C-5），123.2（C-6），115.1（C-7），147.8/147.9（C-8），94.1/98.1（C-1′），75.4/76.0（C-2′），81.7/79.1（C-3′），70.3/70.4（C-4′），73.7/76.1（C-5′），62.3/62.4（C-6′），102.7/102.8（C-1″），72.2（C-2″），72.3（C-3″），74.0（C-4″），70.6/70.8（C-5″），18.5（C-6″），168.4/168.3（-C=O）。以上数据与文献［6］基本一致，故鉴定为cistanoside F。

化合物4：白色粉末，易溶于丙酮、甲醇，ESI-MSm/z：511 ［M+Na］+。1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.03（1H，d，J=1.7 Hz，H-2），6.94（1H，dd，J=1.7，8.1 Hz，H-6），6.78（1H，d，J=8.1 Hz，H-5），7.54（1H，d，J=15.9 Hz，H-7），6.28（1H，dd，J=1.9，15.9 Hz，H-8），4.32（1H，d，J=7.8 Hz，H-1′），5.16/5.05（1H，d，brs，H-1″），3.33～4.01（11H，m，sugar-H），1.24（3H，d，J=6.2 Hz，H-6″）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ：127.7（C-1），114.8/114.9（C-2），149.6（C-3），146.8（C-4），116.5（C-5），123.0（C-6），115.1（C-7），147.1/147.1（C-8），169.0/169.2（C=O），94.1/98.1（C-1′），75.4/76.8（C-2′），81.7/84.0（C-3′），70.0/70.4（C-4′），74.0/74.2（C-5′），64.9/64.8（C-6′），102.7/102.8（C-1″），72.3（C-2″），73.9（C-3″），74.0（C-4″），70.6/70.8（C-5″），17.9（C-6″）。以上数据与文献［6］基本一致，故鉴定为isocistanoside F。

化合物5：白色粉末，HR-ESI-MSm/z：645.178 6 ［M+Na］+。1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.04（1H，d，J=1.9 Hz，H-2），6.72（1H，d，J=8.2 Hz，H-5），6.96（1H，dd，J=1.9，8.2 Hz，H-6），7.59（1H，d，J=15.8 Hz，H-7），6.28（1H，d，J=15.8 Hz，H-8），6.81（1H，d，J=1.5 Hz，H-2′），6.70（1H，d，J=8.1 Hz，H-5′），6.66（1H，dd，J=1.5，8.1 Hz，H-6′），4.56（1H，d，J=2.8 Hz，H-7），3.96（1H，dd，J=2.8，12.0 Hz，H-8），4.49（1H，d，J=7.8 Hz，H-1″），5.19（1H，d，J=1.3 Hz，H-1‴），4.33/4.01（1H，m，H-6″），1.24（3H，d，J=6.2 Hz，H-5‴）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ：127.7（C-1），114.6（C-2），145.5（C-3），146.4（C-4），115.1（C-5），118.9（C-6），78.7（C-7），73.0（C-8），129.9（C-1′），114.7（C-2′），147.3（C-3′），149.7（C-4′），116.5（C-5′），123.1（C-6′），146.8（C-7′），116.2（C-8′），169.0（C=O），99.1（C-1″），81.9（C-2″），78.4（C-3″），70.2（C-4″），77.1（C-5″），64.4（C-6″），101.8（C-1‴），72.1（C-2‴），72.0（C-3‴），73.9（C-4‴），69.8（C-5‴），17.9（C-6‴）。以上数据与文献［7］基本一致，故鉴定为savasides A。

化合物6：淡黄色粉末，HR-ESI-MSm/z：637.177 4 ［M-H］-。1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.42（1H，s，H-2），6.84（1H，d，J=8.0 Hz，H-5），7.44（1H，d，J=1.9，8.0 Hz，H-6），7.60（1H，d，J=15.8 Hz，H-7），6.28（1H，d，J=15.8 Hz，H-8），7.04（1H，d，J=1.9 Hz，H-2′），6.77（1H，d，J=8.1 Hz，H-5′），6.96（1H，dd，J=1.9，8.1 Hz，H-6′），4.48（1H，d，J=7.8 Hz，H-1″），5.28（1H，brs，H-1‴），3.23～4.11（9H，m，sugar-H），1.08（3H，d，J=6.2 Hz，H-6‴）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ：127.9（C-1），115.6（C-2），152.9（C-3），146.7（C-4），116.0（C-5），122.8（C-6），196.6（C-7），73.7（C-8），127.6（C-1′），115.2（C-2′），149.8（C-3′），146.8（C-4′），116.5（C-5′），123.6（C-6′），148.1（C-7′），114.6（C-8′），168.2（C-9′），102.9（C-1″），76.3（C-2″），81.1（C-3″），72.3（C-4″），76.2（C-5″），62.4（C-6″），104.1（C-1‴），72.1（C-2‴），72.0（C-3‴），73.7（C-4‴），70.4（C-5‴），18.4（C-6‴）。以上数据与文献［7］基本一致，故鉴定为β-oxoacteoside。

化合物7：白色粉末，易溶于丙酮、甲醇，ESI-MSm/z：511 ［M+Na］+。1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：6.99（1H，d，J=1.7 Hz，H-2），6.56（1H，dd，J=1.7，8.1 Hz，H-6），6.70（1H，d，J=8.1 Hz，H-5），7.65（1H，d，J=15.9 Hz，H-7），6.32（1H，dd，J=2.0，15.9 Hz，H-8），6.72（1H，d，J=2.0 Hz，H-2′），6.59（1H，dd，J=2.0，8.1 Hz，H-6′），6.71（1H，d，J=8.1 Hz，H-5′），2.77（2H，t，H-7′），3.96（1H，m，H-8′），3.71（1H，m，H-8′），4.37（1H，d，J=7.8 Hz，H-1′），5.19（1H，d，brs，H-1″），3.33～4.12（9H，m，sugar-H），4.95（1H，t，J=9.5 Hz，H-4″），1.24（3H，d，J=6.2 Hz，H-6″）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ：127.6（C-1），115.2（C-2），146.8（C-3），149.8（C-4），116.5（C-5），123.2（C-6），148.0（C-7），114.7（C-8），168.3（C=O），131.4（C-1′），117.1（C-2′），144.7（C-3′），146.1（C-4′），116.3（C-5′），121.2（C-6′），36.6（C-7′），72.3（C-8′），103.2（C-1″），76.2（C-2″），81.6（C-3″），70.6（C-4″），76.0（C-5″），62.3（C-6″），104.2（C-1‴），72.3（C-2‴），72.0（C-3‴），73.8（C-4‴），70.4（C-5‴），18.4（C-6‴）。以上数据与文献［8］基本一致，故鉴定为毛蕊花糖苷。

化合物8：白色无定型粉末，白色粉末，易溶于丙酮、甲醇，ESI-MSm/z：351 ［M+Na］+。1HNMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.11（2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6），6.80（2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5），2.64（2H，t，J=7.5 Hz，H-7），1.87（2H，m，H-8），3.64（1H，dt，J=6.4，9.6 Hz，H-9），4.22（1H，d，J=7.7 Hz，H-1′），3.74（3H，s，-OCH3）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ：135.3（C-1），130.4（C-2，6），159.3（C-4），114.7（C-3，5），32.2（C-7），32.8（C-8），70.0（C-9），104.5（C-1′），75.2（C-2′），77.9（C-3′），71.6（C-4′），78.1（C-5′），62.8（C-6′），55.6（-OCH3）。以上数据与文献［9］基本一致，故鉴定为3-（4′-methoxyphenyl）-propanol 1-O-β-D-glucopyranoside。

化合物9：无色胶状物，HR-ESI-MSm/z：327.136 8 ［M+H］+。1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：6.82（1H，d，J=1.8 Hz，H-2），6.72（1H，d，J=1.8，8.2 Hz，H-5），7.06（1H，d，J=8.2 Hz，H-6），3.47（2H，m，H-7），5.98（1H，m，H-8），5.06（1H，d，J=16.2 Hz，H-9a），5.02（1H，d，J=16.2 Hz，H-9b），4.57（1H，brs，H-1′），3.86（1H，d，J=12.0 Hz，H-6′a），3.69（1H，dd，J=5.0，12.0 Hz，H-6′b），3.83（3H，s，-OCH3）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ：136.5（C-1），114.1（C-2），150.8（C-3），146.3（C-4），118.3（C-5），122.1（C-6），40.7（C-7），139.0（C-8），115.8（C-9），103.1（C-1′），74.9（C-2′），78.2（C-3′），71.3（C-4′），77.8（C-5′），62.5（C-6′），58.7（-OCH3）。以上数据与文献［10］基本一致，故鉴定为丁香油酚-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物10：无色油状物（甲醇），mp 114～116 ℃，ESI-MSm/z：319 ［M+Na］+。1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.41（2H，m，H-2，6），7.29（2H，m，H-3，5），7.21（1H，m，H-4），6.67（1H，d，J=15.9 Hz，H-7），6.33～6.39（1H，m，H-8），4.19～4.24（2H，m，H-9），4.36（1H，d，J=7.6 Hz，H-1′），3.00～3.70（6H，m，H-2′～6′）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ：138.2（C-1），127.5（C-2，6），129.6（C-3，5），128.7（C-4），133.2（C-7），126.7（C-8），70.7（C-9），103.6（C-1′），75.1（C-2′），78.0（C-3′），71.6（C-4′），78.1（C-5′），62.8（C-6′）。以上数据与文献［11］基本一致，故鉴定为苯丙烯醇-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物11：淡黄色晶体，mp 123～125 ℃。ESI-MSm/z：293.0 ［M+Na］+。1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.41（2H，m，H-4，6），7.33（2H，m，H-3，5），7.28（1H，m，H-7），4.93（1H，d，J=11.8 Hz，H-1a），4.66（1H，d，J=11.8 Hz，H-1b），4.33（1H，d，J=8.0 Hz，H-1′），3.87（1H，dd，J=11.7，1.8 Hz，H-6′a），3.69（1H，dd，J=11.7，5.7 Hz，H-6′b），3.15～3.33（4H，m，H-2′-5′）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ：139.2（C-5），129.4（C-3，7），129.3（C-4，6），128.8（C-2），103.4（C-1′），78.2（C-5′），78.1（C-3′），75.2（C-2′），71.8（C-1，4′），62.9（C-6′）。以上数据与文献［12］基本一致，故鉴定为benzyl alcohol glucoside。

化合物12：白色粉末，易溶于甲醇，丙酮。HR-ESI-MSm/z：365.095 4 ［M +Na］+。1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.02（1H，d，J=1.5 Hz，H-2），6.77（1H，d，J=8.1 Hz，H-5），6.92（1H，d，J=8.1 Hz，H-6），7.57（1H，d，J=15.8 Hz，H-7），6.27（1H，dd，J=1.5，15.8 Hz，H-8），5.09（1H，d，J=7.8 Hz，H-1′），3.13～4.50（sugar-H）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ：169.0/ 169.2（C=O），149.6（C-4），147.1（C-7）146.8（C-3），127.6（C-1），123.0（C-8），116.4（C-6），115.0（C-5），114.9（C-2），98.2/94.0（C-1′），77.9/76.2（C-5′），75.4/74.7（C-2′），73.8/72.0（C-3′），71.7/70.7（C-4′），64.9/64.8（C-6′）。以上数据与文献［13］基本一致，故鉴定为6-O-caffeoyl-D-glucopyranoside。

化合物13：黄色粉末，易溶于甲醇，丙酮。遇FeCl3-K3［Fe（CN）6］试剂显蓝色，茴香醛-浓硫酸显黄色（105 ℃），盐酸-镁粉反应呈阳性，Molish 反应呈阳性。1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.51（2H，s，H-2′，6′），6.42（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.20（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），5.47（1H，dd，J=4.7 Hz，H-1″），3.92（6H，s，-OCH3×2），3.24～3.75（4H，m，sugar-H）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz）δ：158.5（C-2），135.9（C-3），179.4（C-4），163.1（C-5），99.8（C-6），165.9（C-7），94.7（C-8），158.4（C-9），105.8（C-10），75.9（C-2″），78.0（C-3″），71.5（C-4″），78.6（C-5″），62.5（C-6″），103.3（C-1″），121.9（C-1′），108.1（C-2′，6′），148.8（C-3′，5′），139.9（C-4′），57.1（-OCH3）。以上数据与文献［14］基本一致，故鉴定为syringetin 3-O-β-D-glucoside。

4 抗氧化活性检测

采用细胞实时监控检测的方法探究化合物对H2O2诱导的NRK-52e 细胞氧化损伤的干预作用，以维生素E（VE）为阳性对照。将NRK-52e 细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养至对数生长期，按照细胞密度为2×104个/mL，每孔2 000 个细胞接种于E-Plate 板（ID725602）中，8 h 贴壁后，H2O2（100 μg/mL）与13 个糖苷类化合物（10 μmol/L）刺激NRK-52e 细胞0.5 h，细胞实时监控仪检测细胞活力，与模型组相比，细胞指数比率=［（给药组-模型组）/模型组］×100%，大于10%则表示化合物对H2O2诱导的NRK-52e 细胞氧化损伤具有保护作用［15］。

对分离得到的13 个糖苷类化合物进行H2O2诱导的NRK-52e 细胞损伤模型的干预作用研究。结果表明，化合物2～3、6～13 对H2O2诱导的NRK-52e 细胞损伤具有保护作用，结果见表1～3。