基于网络药理学研究甘麦大枣汤改善睡眠障碍的作用机制

晏仁义陈衬心李赫宇张东星张 民∗於洪建郑艳超

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457；2.天津益倍生物科技集团有限公司，天津 300457）

睡眠障碍是指在睡眠时间和机会充足的情况下，发生反复入睡、睡眠维持与巩固、睡眠质量差等困难，导致患者日间功能受损。众所周知，良好的睡眠是人体健康的基石，缺乏高质量的睡眠会对人体器官造成不可逆的损伤。近年来随着人们工作节奏的不断加快，生活压力的不断加大，睡眠障碍的发病率也呈上升趋势。据北京朝阳医院发布的 《2018 中国睡眠质量调查报告》显示，在10 万被调查人群中有83.81%经常受到睡眠问题困扰。睡眠障碍会令人疲惫、记忆减退，且头痛、目眩等症状同时出现，严重影响身体健康、生活质量［1］。西药治疗多采用巴比妥类、苯二氮卓类等镇静安眠药，但这些药物会产生依赖、戒断、宿醉等不良反应。中医学注重整体观，具有丰富的理论与实践基础，且不良反应少，因而受广泛关注。

甘麦大枣汤出自 《金匮要略》，由甘草、小麦、大枣组成，3 味药均为常见的药食同源中药。临床和食疗上，甘麦大枣汤用于调理睡眠障碍相关的精神类疾病，主治情志不舒、思虑过度、躁扰不宁的脏躁症［2］。邵圆［3］采用随机抽取方法对门诊产后女性睡眠障碍进行观察，给予甘麦大枣汤治疗2 周后，患者的匹兹堡睡眠表评分有所改善，纠正了抑郁状态。李先晓等［4］通过临床观察发现，应用甘麦大枣汤合酸枣仁汤加减可有效改善更年期患者的失眠症状。现代研究［5］表明甘麦大枣汤具有镇静、催眠、抗抑郁等药理作用，但目前对甘麦大枣汤中的化学成分及如何发挥治疗睡眠障碍的作用机制尚不明确。网络药理学是建立在多基因、多通路、多途径的多层次网络基础上，用于从整体研究中药，具有独特的优势［6］。故本研究采用网络药理学方法探讨甘麦大枣汤改善睡眠障碍主要活性成分和作用机制。

1 方法

1.1 目标化合物的收集 采用TCMSP 数据库（http：//lsp.nwu.edu.cn/），提取甘草、大枣、小麦中化学成分，以口服生物利用度（Oral bioavailabiliy，OB）≥20% 和类药性（Drug-likeness，DL）≥0.18% 作为活性成分筛选条件，同时结合2015 年版《中国药典》 及文献报道对具有药理活性的化学成分提取。

1.2 目标化合物作用靶点的预测 通过TCMSP数据库提取活性成分的作用靶点，将靶点导入UniProt 数据库（http：//www.uniprot.org/）获得靶点对应的基因名称。或通过PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）提取活性成分的结构，导入Swiss 数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）获得靶点的基因名称。

1.3 网络构建及分析

1.3.1 活性成分-靶点网络构建及分析 将化合物和对应靶点整合到Excel 表格中，利用Cytoscape软件绘制甘麦大枣汤的活性成分-靶点的（Component-Target，C-T）网络图。

1.3.2 睡眠障碍相关靶点收集 将“Sleep disorders”关键词输入 到DrugBank（https：//www.drugbank.ca）数据库中，对调控睡眠障碍的基因进行检索，得到共计174 个作用靶点。

1.3.3 “关键成分-关键靶标-关键通路”的网络构建及分析 将甘麦大枣汤活性成分对应靶点，睡眠障碍对应靶点分别导入BioGRID 数据库（https：//thebiogrid.org/），构建睡眠障碍蛋白相互作用网络和甘麦大枣汤化学成分蛋白相互作用网络。将睡眠障碍蛋白相互作用网络和甘麦大枣汤化学成分蛋白相互作用网络分别导入Cytoscape 软件，运用Merge 将睡眠障碍靶点相互作用网络与甘麦大枣汤化学成分蛋白相互作用网络关联起来，采用Network analysis 对网络表征进行分析，获取蛋白相互作用关系，保存CSV 格式文件，并提取degree＞4作为关键靶点。

采用 DAVID 数据库（http：//davki.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp，version 6.7）对甘麦大枣汤作用于睡眠障碍的关键靶点进行生物通路分析，选择P＜0.05，作为与靶点密切相关的重要作用通络，使用Omicshare（https：//www.omicshare.com/tools/Home/index/index.html）对富集分析结果进行可视化，分析甘麦大枣汤治疗睡眠障碍的可能作用机制。

根据DAVID 数据库关键通路中对应靶点，及靶点对应化学成分，构建“关键成分-关键靶标-关键通路”Excel 表格，运用Cytoscape 软件构建“关键成分-关键靶标-关键通路”相关靶标相互作用所构建的多层次多靶标网络图。

2 结果

2.1 活性化学成分的筛选 以OB ≥20% 且DL≥0.18为筛选条件，同时结合药典及文献报道的主要成分，有些成分虽不符合要求，但文献报道具有较强的相关药理活性，本研究也将其纳入活性成分，如甘草酸苷、异甘草素、刺甘草查尔酮等［7-9］。通过筛选，最终获得127 个化合物（甘草95 个，小麦9 个，大枣23 个）。且不同药材之间所含化合物有重叠，如甘草、大枣中都含有C3（白桦脂酸）、C7（齐墩果酸）、C95（槲皮素）等5 个化合物。有研究报道，甘草中甘草次酸能促进大脑分泌内源性物质，从而改善睡眠作用［10］；大枣水提取物可调节神经营养因子表达及抗氧化酶的转录，促进内源性物质分泌，改善睡眠［11］。

表1 各化合物信息Tab.1 Information of various compounds

续表1

续表1

2.2 活性成分-靶点网络构建与分析 将筛选出的活性成分和靶点相连构建（C-T）网络图（图1）。图中共涉及365 个节点（127 种化学成分和238 个靶点）。不同形状的节点分别代表活性成分和靶点，圆形代表作用靶点，V 节点代表活性成分，边代表活性成分和作用靶点间的相互关联。网络中，degree 值可反映节点的重要性，其中degree 值排名靠前的化合物中甘草成分主要有山柰酚（degree=50）、甘草查尔酮A（degree=31）、异甘草 素（degree=29）、甘草素（degree=10）、甘草次酸（degree=6）等；小麦中主要有谷胱甘肽（degree=15）、玉米黄质（degree=15）、豆甾醇（degree=15）等；大枣中主要有β-胡萝卜素（degree=22）、儿茶素（degree=18）、西托糖苷（degree=16）等。

2.3 睡眠障碍靶点收集 对调控睡眠障碍相关的基因在DrugBank 数据检索收集，共有174 个与睡眠障碍相关的疾病靶标用于网络分析，与睡眠障碍相关的靶标信息，见图2。

2.4 “关键成分-关键靶标-关键通路”的网络构建与分析 将甘麦大枣汤化学成分相互作用网络和睡眠障碍相互作用网络互作之后的关键靶点导入DAVID 数据库，对甘麦大枣汤治疗睡眠障碍121 关键靶点进行KEGG 生物通路富集分析。选择P＜0.05，筛选排名靠前的关键通路，用基因个数、P值和Rich factor 来衡量KEGG 富集程度，见图3。Rich factor 是目标基因集中在这个通路的基因数量/背景基因集中在这个通路的基因数量，且Rich factor越大，表示富集程度越高。研究发现，靶点主要富集于HIF-1、ErbB、雌激素等信号通路，采用Cytoscape软件构建“关键成分-关键靶标-关键通路”相关靶标相互作用所构建的多层次多靶标网络图，见图4。

3 讨论

图3 通路富集气泡图Fig.3 Pathway enrichment bubble diagram

本文对甘麦大枣汤化合物-靶点网络进行分析，结果发现degree 值较高的化合物包括3 个黄酮类，分别为山柰酚（degree=50）、甘草查尔酮A（degree=31）、异甘草素（degree=29）；肽类化合物谷胱甘肽（degree=15）；萜类化合物β-胡萝卜素（degree=22）。有文献报道，山奈酚能改善脑缺血大鼠的海马神经元超微结构，具有神经保护作用，改善认知功能障碍［12-13］。谷胱甘肽是一种具有重要生物活性的天然活性肽，在神经系统中，作为一种辅酶因子充当神经递质，抑制氧化应激介导而发挥作用［14-15］。β-胡萝卜素是一种抗氧化剂，膳食摄入可以降低阿尔茨海默病的发病风险［16］。

图4 成分-靶标-通路网络图Fig.4 Component-target-pathway network

本研究基于甘麦大枣汤化学成分238 个靶点和睡眠障碍174 个靶点互作，预测甘麦大枣汤治疗睡眠障碍的主要作用靶点。通过网络分析发现，GSK3B（degree=14）、CALM1（degree=13）、MAPK14（degree=13）、AKT1（degree=12）、MAPK1（degree=12）、ESR2（degree=11）等中心度较高的靶点。有研究报道，GSK3B 是一类在中枢神经系统内高表达的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与大脑神经元的再生过程［17］。周彩凤［18］以四动脉结扎全脑缺血模型，研究延后性脑缺血后处理介导的大鼠海马CA1 区Akt/GSK3B 信号介导通路，发现延迟性脑缺血后处理能够诱导线粒体内GSK3B 磷酸化水平升高。MAPK1 和MAPK14 均是丝氨酸/苏氨酸激酶，MAP 激酶信号转导途径的重要组成部分。甘草总黄酮通过MAPKs 中的细胞外信号调节ERK 信号通路，抑制iNOS和COX-2 基因和蛋白的表达，而起到抗炎效果［19］。AKT1 是3种密切相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶之一，磷酸化后AKT 活化，进一步激活或抑制下游mTOR、GSK 等，参与调控细胞存活、生长、代谢［20］。在成人神经发生过程中，AKT 是AKT-mTOR 信号通路的关键调节因子，控制新生神经元整合过程的节奏，包括神经元的正确定位、树突发育和突触形成。ESR1 是一种配体依赖的转录因子，是雌激素及选择性雌激素受体调节生物学效应的主要介导者［21］。研究发现，ESR1 在MAPK/ERK 和PI3K/AKT 信号通路中，可迅速激活生长因子相关的下游信号转导，从而增强细胞增殖能力［22］。

KEGG 生物通路富集分析发现关键靶点主要富集于HIF-1、ErbB、雌激素等信号通路。HIF-1 信号通路是机体应对缺氧时，在机体形成复杂的反应机制中发挥重要作用，其HIF-1α 是唯一一个特异性缺氧状态下发挥活性的转录因子，参与了PI3K/AKT/HIF-1α、MAPK/HIF-1α 等多条细胞信号通路，是介导缺氧信号的转导中枢［23］。ErbB 信号通路是参与编码髓鞘蛋白，促进神经系统髓鞘形成，保证神经系统功能正常运转［24］。在神经系统中，ErbB 与NRG1 结合后，胞内发生自身酪氨酸磷酸化，并激活下游的Ras/MAPK、PI3K/AKT［25］。甘草查尔酮A 通过抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路而抑制肾癌细胞的增殖、迁移、侵袭，可诱导肾癌细胞自噬［26］。雌激素可以通过调节5-HT、GABA、NA、多巴胺等觉醒神经递质，可间接影响睡眠-觉醒周期，改变睡眠模式［27］。

综上所述，本研究用网络药理学方法初步探讨了甘麦大枣汤配方的主要活性成分、对应靶点、相关疾病及作用生物通路。结果筛选到127 个化合物，174 个与睡眠障碍相关的靶点，靶点主要对应10 条生物通路，为进一步深入探究其作用机制奠定了良好的基础。