鹿角壮骨胶囊对膝骨关节炎兔软骨iNOS 和CollagenⅡ表达的影响

梁子聪王 恒∗胡建山胡先运

（1.黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558000；2.贵州中医药大学第三附属医院，贵州都匀 558000；3.贵州医科大学天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳 510014）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种累及膝关节滑膜、软骨、软骨下骨及关节周围组织的慢性退行性病变，引起老年人膝关节疼痛、畸形及功能障碍的常见疾病［1］。诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）与KOA发病关系密切，能诱导产生大量的NO，抑制软骨细胞分泌细胞外基质和合成Ⅱ型胶原（CollagenⅡ），加速了膝关节的破坏，最终导致KOA 的发生［2-3］。前期研究［4］显示，鹿角壮骨胶囊能改善KOA 患者的临床症状，获得较好的效果。本实验通过建立木瓜蛋白酶诱导兔KOA 模型，观察鹿角壮骨胶囊对关节软骨中iNOS 和CollagenⅡ表达的影响，进一步了解其对KOA 的保护作用。

1 材料

1.1 仪器 JA10002 型电子天平（上海精天电子仪器有限公司）；DDIL-5 型恒温箱（上海安亭科学仪器厂）；ASP300S 型全封闭式组织脱水机、RM2265 型全自动轮转式切片机、HI1210 型摊片机、DM750 型光学显微镜（德国徕卡公司）。

1.2 药物与试剂 鹿角壮骨胶囊由黔南州中医医院制剂科提供（批号黔药制2013003，规格0.45 g/粒）、木瓜蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司，G8430）；甲苯胺蓝染液（北京雷根生物科技有限公司，DA0059）；封闭液（武汉博士德生物工程有限公司）；iNOS、CollagenⅡ多克隆抗体（北京百奥思科生物医学技术有限公司，MD4695、MD4781）。通用型SP 试剂盒、DAB 显色盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，SP-9000，ZLI-9017）；4%多聚甲醛、二甲苯、乙醇、乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）脱钙液由黔南州人民医院病理科提供，其余试剂均为国产分析纯。

1.3 动物 普通级四月龄日本长耳白兔24 只，雌性，体质量（2.0±0.5）kg，由长沙天勤生物技术有限公司提供，生产许可证号SCXK（湘）2014-0010。适应性饲养1 周，分笼饲养，不限制饮食。

2 方法

2.1 造模 24 只兔随机分为正常组、模型组、给药组（鹿角壮骨胶囊），每组8 只。按3.5 mL/kg剂量腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，待完全麻醉后，剪刀于右侧膝关节内侧附近备皮，显露皮肤，碘伏、75%酒精棉签反复消毒。1 mL 注射器抽取提前配制的4%木瓜蛋白酶溶液0.5 mL，微微弯曲膝关节，针尖分别在模型组与给药组兔内侧膝眼进针，回抽确定进入关节腔后，缓慢注射，棉签轻压针眼，避免溶液溢出。正常组同法注射等体积灭菌注射用水。各组被动屈伸右侧膝关节20 次，促进溶液在关节腔内均匀扩散。间隔3 d 重复1次，共注射3 次。末次注射后，各组兔每天驱赶运动30 min，其余时间笼内自由活动。

2.2 给药 首次注射后第2 周，给药组给予鹿角壮骨胶囊药粉0.3 g/kg（参照成人和实验动物等效剂量［5］换算而得），称取体质量的相应剂量，用蒸馏水稀释成10 mL 后灌胃，1 次/d，连续给药4周。其他组给予10 mL 蒸馏水灌胃。

2.3 动物取材 末次给药第2 天，麻醉处死所有实验动物。切开关节囊，取下膝关节及滑膜组织标本，置于4%多聚甲醛中固定。

2.4 兔膝关节软骨甲苯胺蓝染色 甲苯胺蓝染色，将石蜡切片入二甲苯2 次，15 min/次，梯度酒精（100% 1 min，90% 1 min，85% 1 min，75%1 min），自来水冲洗2 min，甲苯胺蓝染料浸染15 min，自来水再次冲洗2 min，丙酮分化至软骨细胞清晰可见，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

2.5 国际骨关节炎研究学会骨关节炎软骨组织病理学评估系统（Osteoarthritis Research Society International Osteoarthritis Cartilage Histopathology Assessment System，OOCHAS）评分 参考文献［6］方法，在光学显微镜下对切片进行OOCHAS 评分，评分标准见表1～3。每个样本取3 次评分的平均值。

2.6 检测兔膝关节iNOS 和CollagenⅡ表达 采用免疫组化检测。石蜡切片经60 ℃烘片1 h，入二甲苯脱蜡2 次，10 min/次、梯度酒精（100% 3 min，90% 3 min，85% 3 min，75% 3 min，蒸馏水3 min，PBS 3 min）。将切片置于 pH=6.0，0.1 mol/L枸橼酸液修复液中，用微波炉100 火力3 min至微微沸腾，再用50 火力维持7 min，停止加热后自然冷却20～30 min。用PBS 漂洗3 次，5 min/次。3% H2O2孵育10 min 以消除内源性过氧化物酶活性。PBS 冲洗3 次，5 min/次。滴加封闭液（5% BSA），在湿盒中室温30 min。用滤纸擦去封闭液，滴加适宜浓度的一抗置湿盒中4 ℃孵胶封片。光学显微镜下进行观察并摄片保存，每张组织切片在相同部位摄取3 个视野（×400）。运用Image-Pro Plus 6.0 专业图像分析软件对图片进行分析，计算相同面积内相关指标阳性表达的平均光密度值（平均光密度值=光密度值/测量面积）。

表1 OOCHAS-分级Tab.1 OOCHAS-grading

表2 OOCHAS-分期Tab.2 OOCHAS-staging

2.7 统计学分析 采用SPSS 22.0 软件对数据进行统计分析。采用Shapiro-Wilk 法作正态检测，Levene 法作方差检测。计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。等级资料比较采用Ridit 分析。P≤0.05 为差异有统计学意义。育过夜（iNOS 为1∶200，CollagenⅡ为1∶150），再用PBS 冲洗3 次，5 min/次，洗去一抗，用滤纸擦去标本外的PBS。滴加生物素化二抗工作液，室温置湿盒中孵育20 min，用PBS 冲洗3 次，5 min/次，洗去二抗，用滤纸擦去标本外的PBS。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温置湿盒中孵育20 min，用PBS 冲洗3 次，5 min/次，用滤纸擦去标本外的PBS。DAB 显色剂显色，自来水充分冲洗。再进行苏木素复染，脱水，透明，中性树

表3 OOCHAS-评分（分）Tab.3 OOCHAS-scoring（scores）

3 结果

3.1 各组兔膝关节镜下病理观察及OOCHAS 评分 正常组兔膝关节面完整，软骨不受累，软骨基质未见肿胀及纤维化，软骨细胞正常，排列整齐（图1A～1B）；模型组兔膝关节软骨表面糜烂、缺损，病损广泛，关节面边缘见骨赘形成，关节面缺损处见纤维组织修复、骨质重建，软骨细胞、纤维细胞增生（图1C～1D）；给药组兔膝关节软骨表面不连续，部分关节面软骨出现垂直裂隙，较严重者可见糜烂，病损范围较模型组轻，下2/3 软骨基质染色变浅，部分见软骨基质内见囊肿形成，软骨细胞肿胀、坏死（图1E～1F）。与正常组比较，模型组OOCHAS 分级和分期的R值、评分总分升高（P＜0.05）；与模型组比较，给药组OOCHAS 评分总分降低（P＜0.05）。见表4。

表4 各组兔膝关节OOCHAS 评分（，n＝8）Tab.4 Rabbit knee joint OOCHAS scores in various groups（，n＝8）

表4 各组兔膝关节OOCHAS 评分（，n＝8）Tab.4 Rabbit knee joint OOCHAS scores in various groups（，n＝8）

注：与正常组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

图1 各组兔膝关节软骨镜下病理形态观察（甲苯胺蓝染色）Fig.1 Pathological changes of rabbit knee articular cartilage in various groups（toluidine blue staining）

3.2 各组兔膝关节iNOS 和CollagenⅡ表达 与正常组比较，模型组兔膝关节软骨iNOS 的表达升高，而CollagenⅡ的表达降低（P＜0.05）；与模型组比较，给药组iNOS 的表达降低，而CollagenⅡ的表达升高（P＜0.05）。见图2、表5。

表5 各组兔膝关节iNOS 和CollagenⅡ表达（，n＝8）Tab.5 Expressions of iNOS and CollagenⅡin rabbit knee joints of various groups（，n＝8）

表5 各组兔膝关节iNOS 和CollagenⅡ表达（，n＝8）Tab.5 Expressions of iNOS and CollagenⅡin rabbit knee joints of various groups（，n＝8）

注：与正常组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

4 讨论

KOA 发病机制十分复杂，目前尚不清楚。但其病理改变包括滑膜细胞增生、慢性炎症细胞浸润，均与炎症因子作用密切相关［7］。一氧化氮合酶分 成3 型，包 括nNOS、eNOS、iNOS，其 中iNOS 与KOA 的发病关系最密切［8］。iNOS 在IL-1等炎症因子作用下，刺激滑膜细胞分泌PGE2和COX-2，加快关节软骨的破坏；同时亦可加快滑膜成纤维细胞增殖，导致滑膜组织纤维化［9］。iNOS还可合成大量的 NO，产生氧自由基，促进CollagenⅡ、Ⅲ及基质蛋白多糖、层粘连蛋白等多种基质蛋白的降解，抑制软骨基质的修复［10］。CollagenⅡ是关节软骨细胞外基质胶原的主要成分（约占胶原总含有量90%以上），其主要作用是维持软骨结构及功能的完整性［11］。当软骨中CollagenⅡ表达减少或网状结构遭到破坏时，可导致软骨基质分泌减少及炎症细胞浸润，从而改变了软骨细胞生存的微环境，加速软骨细胞的凋亡［12］。

图2 各组兔膝关节iNOS 和CollagenⅡ表达（IHC，×100）Fig.2 Expressions of iNOS and CollagenⅡin rabbit knee joints of various groups（IHC，×100）

OA 属中医学中“痹症”范畴，因此膝骨关节炎可称膝痹。膝骨关节炎可致膝关节肿胀、畸形，形似白鹤的膝关节，故又可称为鹤膝风［13］。中医认为本病因年老体衰、肝肾之气耗竭，不能濡养肌肉及骨髓，导致肌肉萎缩、关节活动不利而发病［14］。治则为滋补肝肾、强筋壮骨。鹿角壮骨胶囊以鹿角胶为君药，主归肝、肾经，起到补肾强骨功效。臣以骨碎补、熟大黄、黄芪、当归增强君药补益肝肾之功，佐以血竭、炒土鳖、锻自然铜、白术、川芎等多味中药共凑活血通经、缓急止痛之功。鹿角胶、骨碎补、熟地黄等现代药理学研究［15-16］显示，鹿角胶含药血清能显著促进软骨细胞CollagenⅡ的表达，促进关节软骨基质修复；而骨碎总黄酮可降低软骨中iNOS 的表达，减轻炎症细胞因子对膝关节的破坏。本实验结果显示，与模型组比较，给药组OOCHAS 评分总分明显降低（P＜0.05），iNOS 的表达明显降低而CollagenⅡ的表达明显升高（P＜0.05），说明鹿角壮骨胶囊可通过降低软骨中iNOS 的表达，减轻对Ⅱ型胶原的降解作用，从而起到保护膝关节，延缓关节退变的治疗效果。

综上所述，KOA 发病机制复杂，iNOS 的高表达导致的关节软骨破坏和软骨基质降解仅是KOA发病的机制之一。虽然鹿角壮骨胶囊在临床上治疗膝骨关节炎获得良好的疗效，但对其治疗作用机制了解尚浅，今后仍需进一步探讨。