MTHFR基因A1298C多态性、叶酸与皖北地区非综合征性唇腭裂相关性研究

茆 武 熊竹友 李 薇 李光早

蚌埠医学院；①蚌埠医学院第一附属医院 安徽蚌埠 233030

唇裂伴或不伴腭裂是最常见的先天性畸形之一。流行病学调查显示，在大多数唇腭裂当中，不包括其他系统畸形的非综合征性唇腭裂(non-syndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P)最为普遍。NSCL/P的致病因素主要包括环境因素和遗传因素，已发现IRF6、TGFα、TGFb3、MSX1和CRISPLD2等基因与NSCL/P的发生相关。就发病率来说，亚洲人患病率最高，其次欧洲人，非洲人最低[1]。综合征性唇腭裂(Syndromic cleft lip with or without cleft palate，SCL/P)的病因较为明确,比如最为典型的Van der woude综合征主要是由GRHL3基因和IRF6基因突变引起的[2,3]。亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)位于第一号染色体1p36.3位置，全长20.374 kb，共有外显子12个);其mRNA全长7150 bp，编码656个氨基酸残基组成的蛋白，能催化5,10-亚甲基四氢叶酸转换成5-甲基四氢叶酸盐，使之能为同型半胱氨酸提供甲基形成甲硫氨酸[4]。甲硫氨酸是人体叶酸代谢中的一种重要的酶。研究显示叶酸可预防神经管缺陷，减少新生儿颌面部裂隙的发生[5]。MTHFR基因A1298C位点的突变会引起MTHFR活性下降，从而影响DNA甲基化过程，是近年来国内外比较关注的NSCL/P可能致病因素之一[6,7]。本研究对皖北地区人群MTHFR基因A1298C的多态性及孕妇叶酸摄入情况进行调查,并分析其与NSCL/P的相关性，为NSCL/P防治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1临床资料 收集2018年1月～2019年5月于蚌埠医学院第一附属医院烧伤整形外科及口腔颌面外科就诊的100例NSCL/P患儿，其中男59例，女41例；年龄3个月～20岁，平均4岁。均经两位副高以上职称医生排除其他先天性疾病及其他包含颌面部发育畸形的综合征类疾病，包括范德伍德综合征、先天性心脏病伴唇腭裂、歌舞妓面综合征等。选择同期在本院儿科因呼吸道感染住院的患儿120例为对照组，无先天性畸形，家族中无唇腭裂患者。所有参与者或其监护人在参加本研究前均已签署知情同意书，研究方案经蚌埠医学院伦理委员会批准。

1.2样本采集方法 采集NSCL/P患儿空腹肘静脉血2mL，经乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝处理后-80℃低温保存。对照组通过艾德莱(DN-39)唾液收集器收集唾液2mL,4℃低温保存。对所有研究对象通过调查问卷方式调查母亲妊娠前3个月的叶酸补充情况，其自定义变量为孕前3个月母亲叶酸的补充情况：孕前三月内服用叶酸≥0.4mg/d;孕前三个月未服用叶酸或服用叶酸<0.4mg/d。

1.3DNA提取 采集新鲜血液及唾液，严格按照基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取两组总DNA，用 NanoDrop2000 分光光度计(ThermoScientific 公司) 检测其浓度及纯度，所提DNA浓度均≥20ng/μL，OD260/280值在1.8～2.0之间。-80℃冰箱低温保存。

1.4Taqman实时荧光定量PCR扩增 Primer5设计MTHFR基因A1298C位点基因片段扩增引物序列(由上海生工生物工程有限公司合成)。用96孔板进行PCR扩增反应，反应总体积20μL，包含Premix Ex Taq (Probe qPCR) 10μL、PCR上下游引物各0.4μL、TaqMan荧光探针各0.8μL、ROX reference Dye 0.4μL、DNA模板1μL、灭菌蒸馏水(dH2O)6.0μL。用7500Fast Real-Time PCR System(美国ABI公司)行实时荧光定量PCR，扩增条件为:60℃1min，95℃5min，95℃15s，55℃20s，65℃50s，共40个循环;60℃ 1min。上游引物：5-CTTTGGGGAGCTGAAGGACTACTAC-3；下游引物：5-CACTTTGTGACCATTCCGGTTTG-3。

1.5统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件进行统计处理，基因型及等位基因频率分布进行哈迪温伯格遗传平衡检验(Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE)，如果两组基因型和等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡则采用卡方检验比较两组基因型和等位基因分布的差异，P<0．05为差异有统计学意义。结合流行病学调查表运用SPSS软件分析叶酸摄入与唇腭裂的关系。

2 结果

2.1MTHFR基因A1298C多态性分析 经过HWE平衡检验，观察组和对照组的基因型、等位基因频率分布均符合HWE平衡检验(P>0.05)，见表1。所有患者均来自皖北地区，提取DNA的浓度为40～220ng/μL，由于DNA的浓度及纯度已知，我们可以对qPCR的体积进行调整。结果显示，患者A1298C中C等位基因的频率大于A等位基因的频率，A1298C MTHFR SNP的AA纯合性为2%。杂合子CA的频率为46%,突变纯合子CC频率为52%。观察组与对照组的基因型构成比具有统计学意义(χ2=24.195，P<0.05) ，等位基因构成比具有统计学意义(χ2=11.007，P=0.001)。对MTHFR基因A1298C C等位基因进行分析，统计学分析得出携带C等位基因的新生儿患唇腭裂的风险是非携带C等位基因患儿的2.625倍(OR=2.625，95%CI: 1.473～4.677)， 见表2。CC纯合子与非CC纯合子相比具有统计学意义(χ2=15.897，P<0.05)。CC纯合子患NSCL/P的危险性是非CC纯合子的 3.110倍 (OR=3.110，95%CI: 1.765～5.481) ，见表3。

2.2叶酸摄入与 NSCL/P发病的关系 叶酸摄入与NSCL/P发病相关(χ2=9.547，P=0.002，P<0.05，OR=2.379,95%CI=1.366～4.144),其中孕早期未服用或服用叶酸不足量与NSCL/P发病呈正相关,即孕早期服用叶酸越少,NSCL/P的患病风险越高，见表4。

表1 MTHFR基因A1298C 基因型频率分布与Hardy-Weinberg 平衡

表2 两组 MTHFR 基因 A1298C 多态位点基因型与等位基因比较[例(%)]

表3 两组CC纯合子及非CC纯合子比较(例)

表4 两组孕妇叶酸摄入及统计分析结果(例)

注：Status1：孕早期叶酸摄入充足。Status2：孕早期叶酸摄入不足。

3 讨论

NSCL/P的病因及发病机制复杂，易感基因较多，在不同地区的人群中其易感基因的分布特征及相关性研究结果也不相同，常受多个基因调控；同时又受环境因素影响，是遗传因素和环境因素相互作用的结果，所以这种高度遗传变异性、基因微效性的特点使得NSCL/P在易感性、相关性、致病基因的研究方法上比SCL/P复杂得多。

MTHFR基因的缺陷将导致机体多个基础生化过程的紊乱，包括细胞周期调控、DNA复制、DNA以及蛋白质甲基化修饰等，并进而引发神经管缺陷、癌症、心脑血管疾病等多种病症。MTHFR基因的缺陷对孕妇会引起胎儿神经管缺陷、先天性心脏病、唇腭裂、妊娠期高血压疾病、自发性流产。NSCL/P的发生涉及到多个重要SNPs位点，其中MTHFR基因A1298C就是重要位点之一。该位点A→C突变可引起氨基酸序列中谷氨酸被丙氨酸取代，导致酶的热稳定性和活性降低，最终影响血浆中叶酸和同型半胱氨酸的水平[8]。

近年来国内外学者对于MTHFR基因A1298C位点的研究不多，因种族差异、遗传背景、环境因素等不同，其位点的研究成果在各个地区不尽相同。2018年李三华等[9]研究了MTHFR基因A1298C位点多态性与黔北地区人群NSCL/P的关系,结果显示A1298C位点可能与NSCL/P无关。2015年Ebadifar A等[10]研究了伊朗德黑兰人群MTHFR基因C677T与A1298C位点多态性，发现C677T与NSCL/P相关，而A1298C无关。2013年刘明等[11]研究了MTHFR基因A1298C位点多态性与山西地区人群NSCL/P的关系,结果显示A1298C位点与NSCL/P相关。2011年Blanton等[12]针对美国患者人群NSCL/P的研究结果显示，叶酸代谢途径中MTHFR C677T和A1298C位点多态性均能够促进NSCL/P的发生。2006年万伟东等[13]研究了江苏、安徽地区人群MTHFR基因A1298C和C677T基因，发现MTHFR基因A1298C位点多态性可能是中国人群NSCL/P的遗传易感因素,而C677T位点与中国人群NSCL/P的发生相关。

叶酸别名蝶酰谷氨酸，属于B族维生素，是人体所需的重要营养素，存在于豆类、萝卜、绿叶蔬菜(如菠菜)和一些水果(如柑橘类水果)中。在体内叶酸以四氢叶酸的形式起作用，并作为一碳单位的供体，参与DNA氧化损伤修复、细胞增殖及组织生长、帮助蛋白质的代谢，并与维生素B12共同促进红细胞的生成和成熟[14,15]，与一些先天性疾病的关系密切。孕早期补充叶酸可以降低先天性神经管畸形、先天性心脏病以及NSCL/P的发病风险。Jahanbin A等[16]的Meta分析提示含叶酸的围生复合维生素对口腔裂隙具有保护作用,Dien VHA[17]在越南的研究结果显示，在围生期口服补充叶酸和多种维生素减少了口面裂隙的风险。并建议对于计划怀孕的越南妇女，需围手术期服用叶酸补充剂。Yang W等[18]在加州中部研究了1999～2010年叶酸强化后神经管畸形患病率下降趋势较小，口腔面裂患病率下降趋势加速，同时腹裂患病率上升趋势较慢。但De-Regil LM[19]数据显示，叶酸单独或与维生素和矿物质结合使用，可以预防神经管畸形，但对NSCL/P及其他先天缺陷没有明显的效果。本研究发现孕早期叶酸不摄入或摄入量过低会增加NSCL/P的患病风险,并且叶酸摄入与NSCL/P发病相关。人体内无法合成叶酸,只能从食物中获取,且人体内仅有一部分叶酸可供利用。活性叶酸数量受叶酸摄入量的多少及叶酸代谢路径的影响,若活性叶酸数量下降会导致核苷酸合成异常及一碳单位供应障碍，则会扰乱正常的DNA甲基化程序，进而引起基因印记,X染色体失活,基因特异性表达等过程无法正常进行,导致死胎、先天性畸形等胚胎发育异常。两次表观遗传重编程出现在胚胎发育早期,分别是基因组的快速去甲基化和重新甲基化。唇腭部发育期在胚胎发育的早期,这个时期体内活性叶酸缺乏导致发生异常的DNA甲基化程序，从而增加NSCL/P的发病风险。

本次研究在皖北地区人群中采用病例对照研究方法，同时结合孕妇流行病学调查。结果显示，MTHFR基因A1298C位点多态性与NSCL/P可能存在关联，并且孕早期叶酸摄入不足与唇腭裂发生率成正比。因此建议处于育龄女性，每天服用包括0.4～0.8 mg叶酸在内的多种维生素补充剂，并保持健康的饮食和生活方式。本次研究进行了初步的探讨，唇腭裂发病因素复杂，涉及基因-基因、基因-环境的相互作用，需要排除其他复杂环境因素再进行更多的前瞻性研究以进一步调查孕妇补充叶酸与唇腭裂发生风险之间、环境与NSCL/P之间的关系，为NSCL/P的预防及优生优育提供理论依据。