清香型白酒酒醅乳酸菌分离鉴定及其自溶特性研究

李智琪 - 史 瑛 王萌萌 - 毛 健 张秀红 -

(1.山西师范大学生命科学学院，山西 临汾 041004；2.江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡 214000；3.山西师范大学食品科学学院，山西 临汾 041004)

大曲是白酒酿造的糖化发酵生香剂，除含有产生淀粉酶的霉菌、合成酒精的酵母菌外，还含有大量的细菌，如芽孢杆菌和乳酸菌等。酒醅发酵过程中，除兼性厌氧的酵母菌能快速生长繁殖将还原糖转化为酒精外，厌氧环境还促进了耐氧乳酸菌的大量生长。不同香型酒醅中均检测出含有大量的乳酸菌，陈申习等[1]从清香型小曲酒机械化酿造车间发酵过程中的酒醅中分离得到51株乳酸菌，经形态观察和16S rDNA鉴定为5株干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、10株短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)、8株希式乳杆菌(Lactobacillushilgardii)、28株瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)。杜海等[2]从芝麻香型白酒酒醅中分离筛选出32株乳酸菌，经16S rDNA鉴定为7个种，分别为副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、玉米乳杆菌(Lactobacilluszeae)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidipiscis)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilacti)和戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceu)。乳酸菌在白酒酿造过程中起重要作用，一方面是乳酸菌代谢产生的乳酸是白酒主要的风味物质，在白酒微量成分中占有很大比例，乳酸能起到调和酒味的作用，掩盖酒精的刺激性，还能与多种成分相互亲合，使酒体协调柔和，包括乳酸在内的有机酸含量直接影响白酒的品质[3]；另一方面是乳酸与乙醇酯化合成乳酸乙酯，与乙酸乙酯共同组成清香白酒的主体香气成分[4]。但是，随着气温的回升，酒醅乳酸菌过量生长，酒醅酸度过高，产酒量降低，同时乳酸乙酯随之升高，影响了基酒质量[5]。目前，酒醅乳酸菌的生长控制仍缺乏有效手段。

乳酸菌在一定条件下能释放自溶酶水解细胞壁的主要成分肽聚糖，导致细胞裂解自溶。不同乳酸菌菌株自溶度不同，影响自溶度的因素也较多[6]。关于乳酸菌自溶度的研究主要集中于发酵乳制品发酵剂乳酸菌的研究[7-8]。长期厌氧高酸、高醇酿酒环境对酒醅乳酸菌自溶度的研究尚未见报道。试验拟从清香酒醅中分离乳酸菌，考察其自溶特性，为白酒发酵过程中乳酸菌的控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

清香型酒醅：某清香型白酒企业；

MRS培养基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、磷酸氢二钾2 g、酵母粉5 g、柠檬酸氢二铵2 g、葡萄糖20 g、乙酸钠5 g、吐温80 1 mL、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、蒸馏水1 000 mL，固体培养基加琼脂15～20 g，碳酸钙15 g，121 ℃灭菌20 min，青岛海博生物技术有限公司；

蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、麦芽浸粉：生物试剂，青岛海博生物技术有限公司；

其他试剂：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

PCR反应试剂、DNA Marker：北京全式金生物技术有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

台式高速冷冻离心机：5810R型，德国Eppendorf公司；

双光速紫外—可见分光光度计：A560型，翱艺仪器(上海)有限公司；

PCR仪：ProFlexTMBase型，赛默飞科技有限公司；

pH计：FE20型，梅特勒—托利多仪器有限公司；

立式压力蒸汽灭菌锅：YXQ-LS-50SII型，上海博讯实业有限公司；

电子分析天平：FA2004N型，梅特勒—托利多仪器有限公司；

隔水式恒温培养箱：YHZ-98AB型，上海森信实验仪器有限公司；

凝胶成像仪：Universal Hood II型，美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 清香酒醅乳酸菌的分离纯化 取酸度分别为1.54，1.25，1.16，0.90 mmol/10 g的酒醅各25 g溶解于225 mL无菌生理盐水中，充分混匀，两层无菌纱布过滤。无菌条件下用无菌生理盐水稀释成浓度为10-1～10-77个梯度的样液，每个梯度3个平行，选取10-5，10-6，10-7稀释度的稀释液1 mL于无菌培养皿中，用MRS-碳酸钙培养基浇注，凝固后，置于37 ℃恒温培养箱中培养48 h。挑取平板上有明显溶钙圈的单菌落进行多次划线、分离纯化。并将得到的单菌落进行革兰氏染色、镜检和过氧化氢试验，选择革兰氏染色阳性且过氧化氢酶阴性的菌株初步判断为乳酸菌[9-12]。并用甘油管冷冻保藏法-80 ℃保藏备用。

1.2.2 清香酒醅乳酸菌的分子生物学鉴定 使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法对菌株基因组DNA进行提取[13-14]。16S rDNA扩增引物采用细菌通用引物：正向引物为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物为5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR扩增体系为：2×Taq PCR MasterMix 25 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，模板1 μL，补充去离子水至50 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30个循环，72 ℃延伸10 min，16 ℃保温。扩增反应完毕后，取PCR产物与6×Loading Buffer混合，加样于1.0%的琼脂糖凝胶点样孔中，上机电泳，电泳液为1×TBE，溴化乙锭(EB)染色30 min，电泳结束后将胶板置于凝胶成像系统中观察。若PCR扩增成功，则会在1 500 bp处见到条带并拍照，送至上海生物工程有限责任公司进行测序。

乳酸菌16S rDNA序列分析：将测序得到的乳酸菌16S rDNA序列在NCBI上递交Blast进行同源性分析，并从GenBank数据库中下载与待分析序列相近的公开发表菌株的16S rDNA序列[15-16]。

1.2.3 乳酸菌自溶度检测

(1)菌体培养及处理：活化后菌株培养至对数生长期(OD650 nm为0.9～1.0)后，以4%的接种量接种于MRS液体培养基，37 ℃培养至目标菌体浓度，于4 ℃，5 000 r/min离心10 min，收集菌体。无菌水洗涤两次菌体，然后用PBS(50 mmol/L，pH 6.5)缓冲液重悬，备用。调整菌液吸光值OD650 nm为1.0左右。

(2)自溶度检测方法：将收集的待测菌体细胞悬浮，收集菌体于PBS(50 mmol/L，pH 6.5)缓冲液中，调整菌液吸光值OD650 nm为1.0左右。测定初始OD650 nm。其余上述菌悬液置于培养箱温育24 h，测定OD650 nm。按式(1)计算菌株自溶度[17]。

(1)

式中：

R——自溶度，%；

A0——初始OD650 nm值；

At——24 h后测定的OD650 nm值。

1.2.4 温度对菌株自溶度的影响 取对数生长期的菌体细胞，重悬于pH 6.5的PBS缓冲液(50 mmol/L)中，分别置于15，20，25，50 ℃下温育24 h，测定其自溶度。

1.2.5 pH对菌株自溶度的影响 洗涤菌体分别重悬于pH为3.5，4.0，4.5，5.0的PBS缓冲液(50 mmol/L)中，于37 ℃温育24 h，测定其自溶度。

1.2.6 数据处理 各项指标重复测定3次，运用Excel进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 清香型白酒酒醅乳酸菌的分离、纯化

用MRS-碳酸钙培养基从清香酒醅中分离纯化出47个单菌株，菌落呈圆形，直径为0.5～3.0 mm，米黄色或白色，不透明或半透明，表面湿润光滑，凸起，革兰氏染色阳性，不运动、不产生孢子，过氧化氢酶阴性，可初步确定为乳酸菌。部分菌株的菌落特征及显微特征见图1、2。

图1 部分乳酸菌菌株的菌落特征

图2 部分乳酸菌菌株显微特征

2.2 清香型白酒酒醅乳酸菌菌株的16S rDNA鉴定

由表1可知，与短乳杆菌属(L.brevis)亲缘关系最近的菌株有SL61-1、SL61、SL21、YP49-1、YP62、MC50、SL31、YP37-1、SL63、LMM40、LMM87-1、YP38-1、MC90、YP31-1、MC55-1、SL33-1、YP49、YP37-2、MC46、MC46-2；与布氏乳杆菌属(L.buchneri)亲缘关系最近的菌株有SL45、SL58、SL63-2、SL28、YP15-2、SL7-1、YP8；与植物乳杆菌属(L.plantarum)亲缘关系最近的菌株为YP15-1、SL18、YP37、SL18、YP37、LMM23、MC30-2、SL25-1、MC50-1、YP82-3、SL58-1、SL63-1、LB36、LMM3-3、LB60、LB1-1、MC29、LMM3-5；与戊糖乳杆菌属(L.pentosus)亲缘关系最近的菌株有YP24、LB27、SL33、SL44-1。

表1 47株乳酸菌 16S rDNA 序列 Blast 比对结果

2.3 清香型白酒酒醅乳酸菌的自溶度

张玉玉等[18]研究发现对数生长期菌体的自溶度最高，因此试验选取对数生长中期的菌体测定自溶度。由表2可知，MC46株、MC30-2株的自溶度最高，分别达29.27%，26.62%；SL58株、LMM40株、YP82-3株、YP62株的自溶度最低。L.brevis中，除自溶度最高的L.brevisMC46外，L.brevisLMM40的自溶度仅为5.03%；L.buchneriSL7-1的自溶度达17.29%，L.buchneriYP15-2和L.buchneriSL45的自溶度分别为10.78%，10.51%，L.buchneriSL58的自溶度为5.01%，与张玉玉等[18]的结果类似。

表2 对数生长中期菌株的自溶度

2.4 温度对清香型白酒酒醅乳酸菌自溶度的影响

由图3可知，大部分菌株15 ℃时的自溶度最低，随温度的升高自溶度增大，当温度为37 ℃时，自溶度达到最高。而菌株L.brevisMC46-2在30 ℃时的自溶度最大，达29.18%；菌株L.plantarumMC30-2在低温环境下也表现出较高的自溶度，从25 ℃升温至37 ℃时，自溶度增幅仅为1.66%。

图3 温度对乳酸菌自溶度的影响

图4 pH对乳酸菌自溶度的影响

2.5 pH对清香型白酒酒醅乳酸菌自溶度的影响

由图4可知，菌体自溶与环境pH值密切相关。当pH为3.5时，各菌株自溶度仅为2.65%～6.96%；当pH为3.5～6.5时，菌株的自溶度随pH的增大而增大；当pH为6.5时，各菌株的自溶度增加到20.97%～29.27%。而菌株L.brevisYP49-1在较低的pH下表现出活跃的自溶状态，与Riepe等[19]的研究结果一致。

3 结论

试验表明，从清香型白酒——汾酒酒醅中筛选出的47株乳酸菌经形态及16S rDNA分子生物学鉴定为20株短乳杆菌(L.brevis)、7株布氏乳杆菌(L.buchneri)、16株植物乳杆菌株(L.plantarum)和4株戊糖乳杆菌(L.pentosus)。采用比浊法对4个属的乳酸菌菌株自溶能力进行检测发现，菌株自溶度与菌种没有明显的相关性，表现出菌株特异性。在白酒酿造的温度范围内(约15～35 ℃)，大多数菌株的自溶度随温度的升高而增加；在酒醅发酵的pH范围内(3.5～6.5)，大多数菌株的自溶度随pH的升高而增大。试验初步了解了清香型白酒酒醅乳酸菌的自溶特性，但自溶过程中起主要作用的关键自溶酶和其自溶机理还有待进一步研究。