碳量子点荧光猝灭法检测药物中的异鼠李素

李海红，刘荔贞，冯 锋,*

(1.山西师范大学 化学与材料科学学院，山西 临汾 041004；2.山西大同大学 化学与环境工程学院，山西 大同 037009)

异鼠李素(ISOR)是一种从黄酮类化合物中分离得到的天然单体，主要来源于沙棘果实和银杏叶。ISOR有重要的药用价值，如保护心血管，抗肿瘤抗癌，调节免疫功能，尤其在心血管保护，抑制血管平滑肌细胞增生肥大，抗血栓形成方面[1-2]效果显著。ISOR在疾病治疗领域发挥着极其重要的作用，因此寻找一种简单、快速、高选择性检测ISOR的方法显得尤为重要。目前检测ISOR的方法主要包括薄层色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法和毛细管电泳法[3-6]。但是，这些方法对设备要求高、操作步骤复杂、耗时长、检测成本高。相比于其它分析方法，荧光探针分析法具有操作简单、灵敏度高、高效快速、成本低等优点。

荧光碳量子点(CDs)是一种新型的碳纳米材料，因具有良好的光电性质和广阔的应用前景得到了广泛关注。与传统半导体金属量子点相比，CDs具有亲水性、低毒性、光致发光性、生物相容性、化学及光稳定性和易于功能化等优点。目前合成CDs的方法主要有电弧放电法、激光烧蚀法、电化学氧化法、水热法、超声振荡法和微波法等[7-12]。在这些方法中，微波合成法以其加热均匀、操作简单、量子产率高、耗时短等优势而受到追捧。近年来，CDs在传感、光催化、金属离子检测和细胞成像等领域得到了发展[13-17]，但关于CDs检测ISOR的方法尚未见报道，因此利用CDs检测ISOR具有重要的研究意义。

本文以L-天冬氨酸和尿素为原料，采用微波加热法制备了一种新型的、具有良好荧光稳定性与水溶性的荧光碳量子点。ISOR对该CDs具有明显的荧光猝灭作用，在一定范围内，CDs的荧光猝灭程度与ISOR浓度呈良好的线性关系。将制备的CDs用于药物银杏叶片中ISOR的检测，结果令人满意。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

JEOL-2100F透射电镜(日本JEOL公司)；FT-IR-680傅立叶变换红外光谱仪(天津天光光学仪器有限公司)；Escalab 250Xi X射线光电子能谱(XPS)(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Lambda 35紫外-可见分光光度计(美国Perkin Elmer公司);F-2500荧光分光光度计(日本日立公司);FLS 920荧光光谱仪(爱丁堡仪器有限公司)。

分子截留量500 Da透析膜(北京生物试剂耗材实验室公司)；L-天冬氨酸(天津威臣化学试剂公司)；二甲基亚砜(DMSO)、尿素(天津克美化学试剂公司)；异鼠李素(上海瑞初生物技术公司);阿魏酸(Fer)、芦丁(Rut)、大黄酚(Chr)、大豆黄酮(Dai)(阿拉丁试剂公司)。所有试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水。

1.2 实验方法

1.2.1 CDs的合成称取1 gL-天冬氨酸和1 g 尿素溶解于10 mL蒸馏水中，微波加热4 min，得到深褐色粘稠液体，自然冷却至室温，用20 mL蒸馏水稀释，稀释后溶液呈透明亮黄色。将该溶液经分子截留量为500 Da的透析袋透析24 h，除去溶液中未反应的杂质，冷冻干燥后得到CDs固体产品。

1.2.2 测定方法将0.6 mL CDs溶液(3 mol/L)与1.4 mL的磷酸盐缓冲溶液(10 mmol/L，pH 6.0)混合后，将不同浓度的ISOR加入该溶液中，在固定激发波长(350 nm)下，测定荧光发射光谱(200～700 nm)，发射和激发狭缝均设为5 nm。固定激发波长和发射波长分别为350 nm和370 nm，记录荧光强度IF和IF0(IF和IF0分别为ISOR存在与不存在时的CDs荧光强度)。

2 结果与讨论

2.1 CDs的表征

利用透射电镜进行CDs形貌表征。如图1A所示，制备的CDs为近似球形结构且保持较好的分散性，颗粒大小在2～8 nm之间(图1B)，平均粒径为5 nm。

图1 CDs 的TEM电镜图(A)与粒径分布图(B)Fig.1 TEM image(A) and particle size distribution(B) of CDs

图2 CDs 的XPS光谱(A)、红外光谱(B)、不同激发波长下的荧光光谱(C)以及紫外-可见吸收(Abs)、激发(Ex)、发射(Em)光谱(D)Fig.2 XPS spectrum(A),FTIR(B),fluorescence spectra(C)and UV-Vis absorption spectrum(Abs),excitation(Ex) and emission(Em) spectrum of CDs(D) A1-A3:XPS spectra of C1s,N1s,O1s,respectively;insert in D：photographs of the solution of the CDs taken under visible light(left) and 365 nm UV light(right)

2.2 实验条件的优化

2.2.1 荧光碳点浓度实验考察了CDs浓度对荧光强度的影响。由图3A可知，在0.2～0.6 mmol/L浓度范围内,CDs荧光强度随着CDs浓度增加而增加，浓度为0.6 mmol/L时，荧光强度达到最高值，此后荧光强度随浓度增加而减弱。因此实验选择CDs最佳浓度为0.6 mmol/L。

2.2.2 溶液酸度实验在磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系中考察了pH值对CDs荧光猝灭的影响。如图3B所示，pH 2.0～5.0时，CDs的荧光强度随着pH值的增加而逐渐增大。pH>5.0时，CDs的荧光强度随着pH值的增加而降低，因此实验选择在pH 5.0的缓冲溶液中进行。

2.2.3 反应时间及稳定性室温下，记录了反应时间对CDs荧光猝灭的影响。由图3C所示，加入20 μL ISOR(3 mmol/L)后，2 min内CDs的荧光猝灭程度明显，此后，其猝灭程度趋于平缓，且在1 h内基本保持不变。所以实验选择反应时间为2 min。为了探究CDs的稳定性，将CDs在4 ℃条件下保存3个月，荧光强度无明显变化，说明所制备的CDs具有良好的稳定性。

2.3 共存物质的影响

为了验证CDs的选择性，考察了常见金属离子(Zn2+、Pb2+、Ca2+、Mg2+、Al3+、K+、Na+)和药物中可能存在的成分(阿魏酸、芦丁、大黄酚、大豆黄酮)对CDs荧光强度的影响。金属离子以及化合物浓度均为0.01 mol/L，结果如图3D所示。可以发现，上述物质对CDs的荧光干扰很微弱，基本可以忽略。因此所制备的CDs具有较高的选择性，可用于实际样品的检测。

图3 CDs浓度(A)、pH值(B)、反应时间(C)及常见干扰离子和药物中可能存在的物质(D)对CDs荧光强度的影响Fig.3 Effect of CDs concentrations(A),pH value(B),reaction time(C) and the presence of various metal ions and substances(D) on the fluorescence response of CDs

2.4 标准曲线及检出限

在上述优化实验条件下,ISOR浓度(c，nmol/L)在0.22～180 nmol/L范围内与CDs的荧光猝灭程度(IF0/IF)间存在良好的线性关系，回归方程为IF0/IF=1+0.2111c，相关系数r2=0.999 7，以LOD=3S/K(S为10个空白测量的标准偏差，K为标准曲线的斜率)计算出检出限为1.32 nmol/L。

2.5 荧光猝灭机理

荧光猝灭主要分为静态猝灭和动态猝灭[24]。如图4A所示，ISOR的紫外吸收光谱与CDs的发射和激发光谱重叠，表明CDs与ISOR之间存在能量传递，由于在激发态下发生了能量转移过程，CDs的荧光被ISOR猝灭。荧光寿命检测是研究猝灭机理的重要手段。对于静态猝灭，荧光寿命不发生改变(τ0/τ=1)(τ0和τ分别表示含有和未含ISOR时CDs的荧光寿命)。相反，对于动态猝灭，τ0/τ=IF0/IF，随着ISOR浓度的增加，荧光寿命减弱。如图4B所示，CDs的荧光寿命和(CDs+ISOR)的荧光寿命基本相同(τ0/τ≈ 1)。说明静态猝灭是加入ISOR后CDs荧光猝灭的主要机制。

图4 ISOR的紫外-可见吸收光谱和CDs的荧光激发和发射光谱(A)与 CDs及CDs+ISOR荧光寿命曲线图(B)Fig.4 UV-Vis absorption spectra(Abs) of ISOR，fluorescence excitation(Ex) and emission(Em) spectra of CDs(A) and fluorescence emission decay curves of CDs and CDs+ISOR system(B)

2.6 实际样品测定

选取药店购买的银杏叶片作为实际检测样品。药片去除糖衣研磨成粉末，准确称取0.5 g药品粉末，用V水∶VDMSO=1∶1溶液将其溶解并定至50 mL，超声30 min，取上清液进行测定。取2 mL CDs与样品上清液10 μL充分混合后测定荧光强度，根据标准曲线得出药品中含有异鼠李素0.02 μmol/L。分别加入4、8、12、24、30 μL的标准样品(异鼠李素3 μmol/μL)混合均匀后，依次测量该5组混合液的荧光强度，将得到的荧光猝灭程度结合标准曲线得出实测值。每组实验测定3次，计算回收率，结果见表1。其加标回收率为90.8%～107%，相对标准偏差(RSD)小于 3%。结果表明，本方法可用于药品中ISOR的检测。

表1 银杏叶片中ISOR的测定Table 1 Determination of ISOR in ginkgo leaf tablets

3 结 论

本文以L-天冬氨酸和尿素为原料，采用微波加热法制备了一种新型CDs。实验结果表明，制备的CDs水溶性好、稳定性高，对ISOR具有单一选择性。CDs荧光猝灭程度(IF0/IF)与ISOR浓度在0.22～180 nmol/L范围内呈良好线性关系，检出限为1.32 nmol/L。该方法具有操作简单、成本低、耗时短、环境友好等优点，为ISOR检测提供了一种选择性高、灵敏性好以及抗干扰性强的方法。