积雪草酸通过ROS介导的细胞凋亡抑制胃癌细胞增殖并诱导保护性自噬

杜 军,陈玉忠,李 雷,王 凯,马家驰

(蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科,蚌埠 233000;*通讯作者,E-mail:tsmjc2013@163.com)

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤,在亚太地区高发,严重威胁我国胃癌患者的生命健康。积雪草酸(asiatic acid,Aa)是从伞形科植物积雪草中提取的一种三萜化合物。积雪草在传统的中国和印度医学中都具有很长的应用史。之前的研究报道,积雪草酸具有多种药理学作用,除了抗炎抗氧化和神经保护作用之外[1-4],还具有抗肿瘤作用。例如,积雪草酸通过诱导活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的产生诱导SK-MEL-2人黑素瘤细胞发生凋亡[5],通过促进细胞内Ca2+的释放和增加P53蛋白的表达抑制HepG2人肝癌细胞的增殖[6]。此外,积雪草酸还可以通过激活ERK和P38-MAPK信号通路诱导乳腺癌细胞凋亡和周期阻滞[7]。然而,积雪草酸对胃癌的抗肿瘤作用研究还尚未见报道。本研究重点考察了积雪草酸在体外对胃癌细胞的抗肿瘤作用,并对其作用机制进行初步的探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂 积雪草酸(asiatic acid,Aa)标准品购于美仑生物技术有限公司;伊利替康(CPT-11)、氯喹(chloroquine)和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine)购于美国MedChemExpress有限公司;RPMI 1640含双抗(100 kU/L青霉素、100 mg/L链霉素)培养基购于江苏凯基生物技术股份有限公司;N-乙酰半胱氨酸(NAC)、RIPA裂解液(P0013C)、BCA蛋白浓度测定试剂盒、MTT购于南京碧云天生物技术有限公司;细胞凋亡试剂盒购于南京诺唯赞生物科技有限公司;ECL发光液购于上海天能科技有限公司;cleaved Caspase3、cleaved Caspase9、cleaved PARP、LC3、P62、COXⅣ、Cytochrome C抗体购于美国Cell Signaling Technology股份有限公司;β-actin、羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG购于武汉爱博泰克(ABclonal Technology)生物科技有限公司。

1.1.2 细胞株 BGC-823和HGC-27人胃癌细胞细胞株购于上海中科院细胞库。

1.1.3 仪器 酶标仪(BioTek公司);台式高速冷冻离心机(Thermo公司);微型离心机(Corning公司);CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter公司);电泳仪(Bio-Rad公司);MicroChemi化学发光型凝胶成像系统(Azure公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 BGC-823和HGC-27人胃癌细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中,置于37 ℃,5% CO2孵箱中培养。

1.2.2 MTT检测细胞存活率 将BGC-823和HGC-27人胃癌细胞均匀铺于96孔板中,每孔约为1 000个,细胞贴壁后给与不同浓度积雪草酸(25,50,100 μmol/L),每组5个复孔,置于孵箱继续培养12,24,48,72 h,实验结束前4 h加入20 μl浓度为5 mg/ml的MTT,4 h后吸走96孔板中液体,加入120-180 μl DMSO溶解沉淀,490 nm波长处测定其光吸收值,根据光吸收值换算出抑制率。

为了考察ROS在积雪草酸抑制BGC-823和HGC-27胃癌细胞增殖的作用,同时给与5 mmol/L N-乙酰半胱氨酸与积雪草酸,处理细胞24 h采用MTT实验检测细胞存活率。

为了考察自噬在积雪草酸抑制BGC-823和HGC-27胃癌细胞增殖的作用,先用20 μmol/L氯喹和25 μmol/L 3-甲基腺嘌呤预先处理细胞2 h,再给与积雪草酸处理细胞24 h,再采用MTT实验检测细胞存活率。

1.2.3 细胞凋亡检测 取指数生长期的BGC-823和HGC-27胃癌细胞,均匀铺于6孔板中,约2×104个/孔,次日,加入不同浓度的积雪草酸(25,50,100 μmol/L)处理24 h,以10 μmol/L伊利替康(CPT-11)作为阳性对照,消化后500 r/min离心5 min,用PBS洗涤2次后加入500 μl Binding Buffer、5 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI,避光孵育5 min后上流式细胞仪检测。

1.2.4 线粒体/胞浆细胞组分提取分离 采用Thermo Scientific的Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells(货号89874)进行BGC-823和HGC-27胃癌细胞的线粒体/胞浆提取分离。适宜密度BGC-823和HGC-27胃癌细胞均匀铺于细胞培养板中,待细胞贴壁后,给与积雪草酸处理24 h收集细胞,根据试剂盒说明书进行线粒体/胞浆的分离提取操作。

1.2.5 Western blot检测凋亡相关蛋白与自噬相关蛋白的表达 ①收集细胞样本,12 000g离心15 min后吸取上清置于另一干净1.5 ml离心管中,加入1/4体积5×loading buffer,混匀后100 ℃处理5-10 min,置于-20 ℃备用。②制备SDS-PAGE凝胶,根据待检测蛋白的分子量和SDS-PAGE凝胶的最佳分子范围选择配制适合浓度的SDS-PAGE凝胶。③电泳,第一步电压80 V,40 min,第二步电压120 V,60 min。④湿转,根据待检测蛋白的分子量决定湿转时间,湿转电压维持在80 V以上。⑤封闭,非磷酸化蛋白采用5%脱脂奶粉室温封闭1-2 h,磷酸化蛋白采用5% BSA室温封闭1-2 h。⑥洗脱封闭液,加入一抗,包括cleaved Caspase3、cleaved Caspase9、cleaved PARP、LC3、p62、COXⅣ、cytochrome C、β-actin(5% BSA稀释,稀释比1 ∶1 000),4 ℃孵育过夜。⑦次日回收一抗,TBST洗膜,5 min×4次,加入二抗(5% BSA稀释,稀释比1 ∶5 000),室温孵育1 h,TBST洗膜,5 min×4次。⑧ECL发光液显影。

1.2.6 ROS和GSH测定 ROS和GSH均采用碧云天的检测试剂盒,根据试剂盒说明书进行测定。取对数生长期的BGC-823和HGC-27胃癌细胞种植于96孔板中,约1 000个/孔,待细胞贴壁后,加入不同浓度积雪草酸(25,50,100 μmol/L)处理细胞24 h,以10 μmol/L伊利替康(CPT-11)作为阳性对照,根据试剂盒说明书进行后续的检测操作。

2 结果

2.1 积雪草酸抑制BGC-823和HGC-27胃癌细胞的增殖

MTT实验结果显示,除了积雪草酸作用12 h,在24,48,72 h,积雪草酸浓度增加时,BGC-823和HGC-27两株胃癌细胞的存活率逐渐降低(P<0.05);且随时间延长,BGC-823和HGC-27胃癌细胞的存活率也逐渐降低(P<0.05,见图1)。积雪草酸对BGC-823和HGC-27胃癌细胞的增殖抑制作用呈时间依赖性和浓度依赖性,与0 μmol/L相比差异具有统计学意义(P<0.05)。

与0 μmol/L相比,*P<0.05;与0 h相比,#P<0.05

2.2 积雪草酸诱导BGC-823和HGC-27胃癌细胞发生凋亡

流式实验结果显示,随积雪草酸浓度增加,BGC-823和HGC-27胃癌细胞的凋亡率逐渐增加(见图2)。BGC-823细胞分别加入25，50，100 μmol/L积雪草酸处理后，凋亡率分别为(10.37±4.35)%,(17.88±3.87)%,(25.66±5.66)%,阳性对照10 μmol/L伊利替康组的凋亡率为(12.86±3.22)%;HGC-27细胞分别加入25，50，100 μmol/L积雪草酸处理后，凋亡率分别为(13.89±3.34)%,(54.37±4.92)%,(69.14±5.25)%,阳性对照10 μmol/L伊利替康组的凋亡率为(24.76±3.67)%。与0 μmol/L相比，不同浓度积雪草酸作用于BGC-823细胞和HGC-27细胞,细胞凋亡率差异均具有统计学意义(P<0.05,见图2)。表明积雪草酸可以诱导两株胃癌细胞发生凋亡。

与0 μmol/L积雪草酸相比,*P<0.05

2.3 积雪草酸激活线粒体凋亡途径

由Western blot实验结果可知,随着积雪草酸浓度的增加,BGC-823和HGC-27胃癌细胞中cleaved Caspase 3、cleaved Caspase 9、cleaved PARP的表达也明显增多(P<0.05,见图3)。同时,积雪草酸还增加了细胞质中细胞色素C(cytochrome C)的表达并减少了线粒体中细胞色素C的表达(P<0.05,见图3),提示细胞色素C从线粒体中释放进入细胞质中。以上结果说明,积雪草酸激活了BGC-823和HGC-27胃癌细胞中的线粒体凋亡途径。

与0 μmol/L相比,*P<0.05

2.4 积雪草酸促进BGC-823和HGC-27胃癌细胞中ROS的生成

结果显示,随着积雪草酸浓度的增加,BGC-823和HGC-27胃癌细胞中ROS的水平增加,25,50,100 μmol/L积雪草酸处理BGC-823和HGC-27细胞24 h后,BGC-823胃癌细胞中ROS水平分别上调了1.26±0.35倍、1.82±0.21倍、2.07±0.25倍,阳性对照10 μmol/L伊利替康组上调了1.45±0.36倍;HGC-27细胞中ROS水平分别上调了1.25±0.08倍、1.71±0.19倍、1.89±0.23倍,阳性对照10 μmol/L伊利替康组上调了1.46±0.13倍,并且与空白对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05,见图4)。还原性谷胱甘肽(GSH)是细胞中最重要的抗氧化物质之一,25,50,100 μmol/L积雪草酸处理BGC-823和HGC-27胃癌细胞24 h,BGC-823细胞中GSH相对水平分别为0.95±0.04,0.61±0.17,0.36±0.12,阳性对照10 μmol/L伊利替康组为0.68±0.31;HGC-27细胞中GSH的相对水平分别为0.93±0.02,0.51±0.10,0.25±0.03,阳性对照10 μmol/L伊利替康组为0.51±0.46,与空白对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05,见图4)。这些结果表明积雪草酸诱导BGC-823和HGC-27胃癌细胞氧化应激的发生。

ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(5 mmol/L)、积雪草酸(50 μmol/L)单独或联合处理BGC-823和HGC-27胃癌细胞24 h,MTT实验结果显示,N-乙酰半胱氨酸减弱了积雪草酸的增殖抑制作用。在BGC-823细胞中,N-乙酰半胱氨酸(5 mmol/L)组存活率为(103.24±5.33)%、积雪草酸(50 μmol/L)组存活率为(49.87±4.87)%、N-乙酰半胱氨酸(5 mmol/L)+积雪草酸(50 μmol/L)组存活率为(91.27±4.79)%;在HGC-27细胞中,N-乙酰半胱氨酸(5 mmol/L)组存活率为(102.31±3.42)%、积雪草酸(50 μmol/L)组存活率为(52.85±1.83)%、N-乙酰半胱氨酸(5 mmol/L)+积雪草酸(50 μmol/L)组存活率为(88.64±0.99)%,且N-乙酰半胱氨酸(5 mmol/L)+积雪草酸(50 μmol/L)组与积雪草酸(50 μmol/L)组相比差异具有统计学意义(P<0.05,见图4)。以上结果说明,积雪草酸通过诱导氧化应激发挥抗胃癌作用。

图4 积雪草酸通过诱导氧化应激抑制BGC-823和HGC-27胃癌细胞增殖

2.5 积雪草酸诱导保护性自噬

线粒体损伤与自噬密切相关,因此考察自噬是否参与了积雪草酸对BGC-823和HGC-27胃癌细胞的增殖抑制。LC3-Ⅰ(19 kD)向LC3-Ⅱ(17 kD)的转化以及P62的下调是自噬发生的重要标志,Western blot结果显示,积雪草酸浓度依赖性地抑制LC3-Ⅰ的表达并上调LC3-Ⅱ的表达,差异具有统计学意义(P<0.05),提示LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化。同时积雪草酸还抑制了P62的表达,并且差异也具有统计学意义(P<0.05,见图5),提示积雪草酸可诱导BGC-823和HGC-27胃癌细胞发生自噬。MTT结果显示,预先给与20 μmol/L氯喹或者25 μmol/L 3-甲基腺嘌呤自噬抑制剂抑制自噬的发生,与单独积雪草酸处理相比,预先用自噬抑制剂处理的细胞生存率明显降低,并且差异具有统计学意义(P<0.05,见图5)。以上结果说明积雪草酸诱导BGC-823和HGC-27胃癌细胞发生保护性自噬。

与0 μmol/L相比,*P<0.05;与50 μmol/L相比,#P<0.05

3 讨论

本研究通过考察积雪草酸对BGC-823和HGC-27胃癌细胞增殖、凋亡、ROS水平、GSH水平和自噬的影响,证实了积雪草酸可以抑制BGC-823和HGC-27胃癌细胞的增殖,通过促进ROS的产生激活线粒体途径从而诱导BGC-823和HGC-27胃癌细胞发生凋亡,同时还可以诱导保护性自噬,积雪草酸联合自噬抑制剂可以增强对BGC-823和HGC-27胃癌细胞的增殖抑制作用。

凋亡是细胞为维持内环境稳定,由基因控制的自主有序的死亡。可由两种途径介导:一是TNF-α介导的死亡受体途径,又称外源性途径,二是线粒体途径,又称内源性途径[8]。在受到凋亡刺激信号如ROS刺激时,线粒体膜电位下降导致细胞色素C从线粒体中释放进入细胞质中,并与Apaf-1结合形成复合物从而活化Caspase 9[9],进而激活下游Caspase 3,执行凋亡指令。积雪草酸促进了Caspase 3、Caspase 9和PARP的剪切,以及线粒体中细胞色素C的释放,证明积雪草酸通过线粒体途径诱导胃癌细胞发生凋亡,这与积雪草酸在其他肿瘤细胞中的作用相一致[10,11]。

自噬在化疗导致的肿瘤细胞死亡中扮演着重要角色,自噬是一个涉及自噬通量的动态过程,通过刺激自噬体形成,吞噬细胞内容物,与溶酶体融合,导致内容物的降解[12]。自噬既有积极的一面,也有消极的一面。一方面,它被视为一个生理过程,在细胞遇到饥饿或病原体感染等环境压力时发挥保护作用[13],另一方面,过度的自噬可以作为一种促死亡机制[14]。在BGC-823和HGC-27两株胃癌细胞中,积雪草酸均促进LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化,证明了积雪草酸诱导了自噬的发生。此外,我们联合了两种自噬抑制剂氯喹和3-甲基腺嘌呤与积雪草酸一同作用BGC-823和HGC-27胃癌细胞,发现积雪草酸的抗胃癌增殖作用明显增强,从而证明积雪草酸诱导BGC-823和HGC-27胃癌细胞发生的自噬是保护性自噬。不仅如此，其他的一些临床化疗药物也常常诱导保护性自噬，抑制这种保护性自噬对增强化疗效果具有重要意义[15-17]。

综上所述,本研究证实了积雪草酸对胃癌细胞的杀伤作用,并提示了积雪草酸通过诱导ROS介导的线粒体凋亡从而抑制胃癌细胞增殖的机制。同时,我们还发现积雪草酸可诱导胃癌细胞发生保护性自噬,提示抑制该自噬对增强积雪草酸抗肿瘤疗效的意义。