超声微泡靶向介导NT-3在治疗脊髓损伤中的意义

蒋婉婷,李令民,张 旗,乔敏霞

(西安市第四医院超声影像科,西安 710004;*通讯作者,E-mail:qmx12306@126.com)

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是临床常见的一种疾病,近年来随着交通业的发展,其发生率逐渐接近发达国家水平[1]。SCI分为原发性损伤和继发性损伤,原发性损伤在受伤即刻发生,没有有效的治疗方式;继发性损伤是在原发性损伤的基础上出现局部的缺血、水肿、氧化应激等改变,这些病理过程往往导致局部微环境紊乱,进而出现神经营养因子的缺乏,最终影响神经功能的恢复[2]。NT-3是对SCI功能恢复作用最强的神经营养因子之一,可以促进神经传导束的生长和神经细胞功能的恢复,所以,增加损伤局部NT-3的表达对于治疗SCI有着重要意义[3,4]。超声靶向微泡破裂技术近年来成为基础领域研究的热点,主要机制是体外目的基因与超声微泡结合后导入体内,再进行体外超声辐照,利用微泡在超声辐照下产生的空化效应,在细胞膜上形成可逆孔隙,从而使目的基因更容易进入细胞,最终达到靶向治疗目的,这种方法具有安全和转染效率高的优点[5,6]。基于此,本课题采用超声微泡靶向介导NT-3治疗SCI,期待这种方法可以提高SCI的修复效果,进而为临床治疗SCI提供一种新的可能。

1 材料与方法

1.1 实验动物

2月龄雌性SD大鼠40只,清洁级,体质量200-220 g。动物由西安交通大学医学部动物实验中心提供,生产许可证号:SCXK(陕)11-018。本研究经西安交通大学医学部伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器

携带NT-3基因的超声微泡(由西安交通大学第一附属医骨科提供),NSE抗体(Abcam,美国,货号::ab53025),Caspase-3 (Abcam,美国,货号:ab179517),IL-1β(Sigma,美国,货号:RAB0277-1KT),IL-6(Abcam公司,美国,货号:ab222503),倒置相差显微镜(Olympus,日本,型号:CKX53);数码显微照相系统(Nikon公司,日本,型号:DS-Ri1-U2)。

1.3 携带NT-3超声微泡的构建

将二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPC)5 mg,二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPE)2 mg,pcMV6-NT-3-RFP质粒0.4 mg,甘油50 μl,PBS 450 μl加入培养皿中,密闭后置于40 ℃恒温水浴箱中60 min,注入氧气及全氟丙烷混合气体,置于银汞胶囊调和器中机械振动2 min,静置10 min后,加入1.5 ml PBS缓冲液稀释,即得2 ml携带NT-3的脂质微泡,低速离心,漂洗3次,即得到纯化的脂质微泡,辐照灭菌后备用。

1.4 脊髓损伤模型的建立与动物分组

随机将大鼠随机分为4组,每组10只。参照Li等[7]方法制作大鼠SCI打击模型,参照宋昭君等[8]方法进行超声照射。①对照组打开椎板,未做打击;②SCI组打击后不给任何处理;③NT-3微泡组打击后经鼠尾静脉注射0.5 ml NT-3微泡;④NT-3微泡+超声照射组打击后经鼠尾静脉注射0.5 ml NT-3微泡,超声照射(2.5 W/cm2,5 min),每12 h一次,连续7 d。

1.5 BBB评分、形态学和炎症介质检测

按照以下步骤进行操作:①术后1 d和7 d对各个组进行BBB评分(n=10),评分越高说明大鼠运动功能恢复越好。②术后7 d,将不同组别大鼠脱颈处死,逐层切开分离组织,脊髓组织以损伤中心取出(n=3),用4%的多聚甲醛固定2 d,梯度脱水后,石蜡包被切片,切片厚度5 μm,进行NSE染色和Caspase-3染色,阳性表达为胞浆内出现棕黄色或褐色颗粒,在低倍镜(×200)下选取阳性表达密集区,在高倍镜(×400)下观察细胞形态、染色定位和程度,采用阳性细胞计数来评价其阳性表达,每组取6张切片,随机取5个不同重叠视野进行阳性细胞计数,并进行统计学分析。③术后7 d,各组(n=3)大鼠脊髓织取出后用PBS在冰上匀浆,4 ℃,10 000 r/min离心30 min,随后收集上清液进行ELISA。采用ELISA试剂盒来检测组织中的炎性细胞因子(IL-1β,IL-6)。

1.6 NT-3mRNA的表达情况

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

引物上游 下游 β-actin5′-AGATCCTGACCGAGCGTGGC-3′5′-CCAGGGAGGAAGAGGATGCG-3′NT-35′-CGTGGTGGCGAACAGAACAT-3′5′-GGCCGATGACTTGTCGGTC-3′

1.7 统计学分析

采用SPSS18.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示,三组或三组以上的比较采用单因素方差分析,其中两组间比较采用SNK-q检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 BBB评分

术后1 d和7 d BBB评分SCI组、NT-3微泡组和NT-3微泡+超声照射组显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。术后1 d SCI组、NT-3微泡组和NT-3微泡+超声照射组BBB评分之间无统计学差异;术后7 d,NT-3微泡+超声照射组BBB评分显著增高,与各组相比差异有统计学意义(P<0.05,见表2)。

2.2 Caspase-3免疫组织染色

对照组脊髓组织形态规则,仅见少量棕褐色的凋亡细胞,为正常生理现象(见图1)。其他三组与对照组相比,凋亡细胞差异有统计学意义(P<0.05)。NT-3微泡+超声照射组凋亡细胞显著低于SCI组和NT-3微泡组,差异有统计学意义(P<0.05,见图1)。

分组1d7d对照组20.17±0.7220.50±0.32SCI组0.92±0.52∗1.23±0.48∗NT-3微泡组1.11±0.39∗1.47±0.43∗NT-3微泡+超声照射组1.01±0.50∗5.01±0.21∗#△

与对照组比较,*P<0.05;与SCI组相比,#P<0.05;与NT-3组相比,△P<0.05

2.3 NSE免疫组化染色

对照组脊髓组织规则,可见形态规则的神经元细胞,数量其他三组显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。NT-3微泡+超声照射组神经元数量显著高于SCI组和NT-3微泡组,差异有统计学意义(P<0.05,见图2)。

2.4 炎症介质表达

相对于对照组,IL-1β和IL-6在SCI组、NT-3微泡组、NT-3微泡+超声照射组中显著增高,差异有统计学意义(P<0.05)。SCI组和NT-3微泡组间炎症介质水平无统计学差异,但较NT-3微泡+超声照射组显著增高,差异有统计学意义(P<0.05,见图3)。

图1 超声微泡靶向介导NT-3对Caspase-3表达的影响 (×400)

图2 超声微泡靶向介导NT-3对各组NSE表达的影响 (×400)

与对照组比较,*P<0.05;与SCI组相比,#P<0.05;与NT-3组相比,&P<0.05

2.5 NT-3 mRNA表达

NT-3微泡+超声照射组NT-3 mRNA表达显著高于其他三组,差异有统计学意义(P<0.05);NT-3微泡组、SCI组与对照组相比,NT-3 mRNA表达增高,但无统计学差异(见图4)。

与对照组比较,*P<0.05;与SCI组相比,#P<0.05;与NT-3组相比,&P<0.05

3 讨论

SCI作为一种致残、致死率极高的疾病,临床主要采取以下几个方式予以治疗[9-11]:①手术解除脊髓压迫,增加椎体稳定性,防止进一步损伤;②使用激素和营养神经的药物,抑制局部炎症反应和改善微环境;③通过针灸、理疗等措施促进功能恢复。这些方式对SCI的治疗有一定的意义,但离理想中的效果差距甚远,究其原因在于损伤局部会出现微环境紊乱、炎症细胞浸润、神经元凋亡、神经营养因子缺乏等改变,所以,全面研究SCI的病理改变,解决上述问题,对于提高SCI的治疗效果至关重要。

近年来超声微泡技术逐步兴起,为治疗SCI带来了新的可能。超声微泡最初只是被美国FDA批准的一种超声造影剂,但随着研究的深入,越来越多的研究者发现其在治疗疾病中也有着重要作用[12-14]。在超声波的作用下,微泡中的固定气体会发生压缩和膨胀从而破裂,进而释放携带的药物或基因,依靠这种机制超声微泡可以成为临床上靶向治疗的载体[15]。在中枢系统疾病中,超声微泡更是具有重要意义,其具备的“声孔效应”,可以导致生物体局部组织的血管壁或一些生物屏障会暂时性地产生许多微孔,从而可以促进血液和这些局部组织中的物质交换,进而使得药物更加容易通过血脑屏障、血脊髓屏障,从而提高治疗效果[16,17]。NT-3是神经营养素家族中重要的成员,它在神经系统发育、中枢神经元的保护、周围神经再生等方面发挥着重要的作用,具有广泛的生物活性,NT-3与TrkC受体结合后启动一系列包括TrkA、TrkC和磷脂酶C在内的信号途径,这些信号途径对于神经元自身的信号表达和功能状态具有调节作用[18]。将NT-3注射至SCI局部,可以改善微环境,通过抑制IL-1β和IL-6等炎症因子表达,调控炎症反应,通过抑制Caspase-3的表达,抑制细胞凋亡;从而降低神经元的死亡,其被证实对SCI有积极的治疗作用,但这种方式由于血脊髓屏蔽的存在,使得NT-3通过率较低且作用时间较短,无法起到长效作用[19,20]。基于此,本课题将上述两种措施联合使用,即采用超声微泡靶向介导NT-3治疗SCI,期待这种方式可以提高SCI的修复效果。

本研究中,我们发现术后1 d各组间BBB评分无明显差异,这是由于伤后时间太短,各种治疗措施尚未发挥作用,所以效果微弱。术后7 d,与其他三组相比,NT-3微泡+超声照射组BBB评分显著增高、细胞凋亡减少、残存神经元增多,炎症介质表达降低,NT-3 mRNA表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。这就说明NT-3微泡+超声照射可以对SCI的治疗起到积极意义,分析其可能的原因是:超声微泡靶向介导NT-3可以增加其在脊髓组织中的表达,从而改善局部微环境,进而在一定程度上抑制局部炎症介质的表达、减少神经元的凋亡和增加残存神经元的数量,最终为后期功能的恢复提供基础。但是我们也发现NT-3微泡+超声照射虽然可以提高SCI后大鼠后肢的功能(5.01±0.21),但与对照组(20.50±0.32)差距仍然十分显著,这就说明这种方式只能微弱地改善大鼠后肢功能,离恢复还有很长的路要走,另外,本课题只观察至伤后7 d,时间较短,远期效果有待进一步观察。

综上所述,本实验发现超声微泡靶向介导NT-3对大鼠SCI有着积极的治疗作用,这对全面研究SCI的修复机制有着重要意义。