单核细胞趋化蛋白-1经细胞外信号调节激酶通路对肺癌A549细胞增殖、侵袭转移的影响及机制*

黄 婷 兰 蕙 王琳琳 韩垠超 叶丽平，2△

（锦州医科大学基础医学院，1 病理生理学教研室，2 生物人类学研究所，锦州 121001）

肺癌中非小型细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）多见，且易转移，是患者死亡的主要原因[1]。研究表明，多种细胞因子参与调节肿瘤细胞的侵袭与转移。单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1/CCL2）是调节巨噬细胞迁移和浸润的关键趋化因子之一[2]，在神经胶质瘤，卵巢癌，前列腺癌等肿瘤组织中过表达，经细胞外信号调节激酶（extracellular-signal regulated kinase，ERK）、 蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）等多条信号通路参与调节肿瘤细胞的侵袭与转移[3-4]。N-钙黏蛋白（N-cadherin）是上皮-间质化（epithelialmesenchymal transition，EMT）重要标志物，可使肿瘤细胞获得迁移能力[5]。基质金属蛋白酶-14（matrix metalloproteinase-14，MMP-14）、 基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2），主要参与细胞外基质的降解和代谢[6]。MCP-1 在NSCLC 中表达上调，与侵袭转移有关，但机制尚不清楚。本研究外源性加入MCP-1，探究MCP-1 是否经ERK 通路调节肺癌A549 细胞N-cadherin、MMP-14 及MMP-2 的蛋白表达及对其增殖、侵袭转移的影响，对临床上早期诊断、靶点治疗及预后评估等具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材料及分组

人肺癌细胞株A549 细胞（本室保存）；1640培养基（美国Gibco）；MCP-1（美国Signalway Antibody）；ERK 通路抑制剂PD98059（APEXIO）、胎牛血清（美国CLARK Bioscience）；Matrigel 基底胶（BD）、Transwell 小室（康宁生物技术有限公司）；抗p-ERK 和抗t-ERK（Abbkine）；抗N-cadherin、抗 MMP-2、抗 MMP-14 和 抗β-actin抗体（博奥森生物技术有限公司）；二甲基亚砜（美国Sigma 公司）。

1.2 细胞培养

将肺癌A549 细胞培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基中，置于5%CO2、37℃恒温细胞培养箱中培养，每2 d 更换培养液，所有操作均在超净工作台中进行。实验均选用对数期生长细胞。待细胞贴壁生长铺满瓶壁70%～80%时无血清饥饿过夜。

1.3 分组

对照组，MCP-1组（25、50、75、100 ng/mL），MCP-1组（75 ng/mL）+PD98059组，PD98059组。ERK抑制剂PD98059终浓度为100 µmol/L（提前 30 min孵育）。

1.4 MTT 法

取对数期细胞，细胞计数，调整细胞为5×105/mL，以每孔100 μL接种到96 孔板中，四周用PBS 填充。5%CO2，37℃孵育至细胞贴壁，去除培养基；按实验分组加药，设6 个复孔；孵育 48 h 后，每孔加入20 µL MTT溶液（5 mg/mL），继续培养4 h。终止培养，去掉培养液。每孔加入150 µL 的DMSO，置37℃摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值。

细胞增殖率=（实验组OD 值/对照组OD 值）×100%

1.5 划痕实验

取对数期细胞，各组细胞按5×105个/孔接种到6 孔板内，待细胞铺满皿底后，用200 µL 枪头垂直划痕，PBS 洗3 遍。按照实验分组加药。每组设2 个复孔。在5%CO2，37℃孵育48 h 后监测划痕宽度变化并照相，Image J 软件分析划痕面积，计算愈合率。

划痕愈合率=（原始划痕面积-48 h 后划痕面积）/原始划痕面积×100%

1.6 Transwell 侵袭实验

Matrigel 胶于与1640 培养液按1：9 稀释，每上室各加入60 μL，置于 37℃、5%CO2的培养箱中，孵育4 h。取对数生长期细胞消化处理，制成细胞悬液（密度为5×105/mL），每上室100 μL。下室按分组加药，孵育48 h。去除上孔培养基，4%多聚甲醛固定10 min，用结晶紫染色，PBS 洗3 次。采用倒置显微镜观察并拍照。

1.7 免疫印迹检测

取对数期生长细胞，按实验分组加药后，于冰上收刮不同处理组细胞，裂解细胞，采用BCA法定量蛋白后制成样品后，进行SDS-PAGE 电泳，半干转膜至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h 后，分别加入一抗，4℃摇床孵育过夜。次日TBST 洗膜，室温孵育二抗90 min。用TBST 洗3 次后，将ECL 显影液均匀涂在PVDF 膜上，置于显影仪上显影，Image J 软件计算分析蛋白灰度值。

1.8 统计学处理

以上实验至少重复 3 次，运用SPSS 17.0 软件分析数据，各组数据以±s表示，组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 细胞增殖能力

与对照组相比，MCP-1 组随浓度增加明显促进细胞增殖（P＜0.05），PD98059 组增殖能力降低（P＜0.05），浓度75 ng/mL 与100 ng/mL MCP-1 组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。MCP-1+PD98059 联合处理组细胞增殖能力低于MCP-1 组（75 ng/mL）（P＜0.05）。

表1 不同浓度MCP-1 作用下细胞增殖率 与吸光度值（n=6，±s）Tab1 Effect of different concentrations of MCP-1 on cell proliferation rate and OD Value（n=6，±s）

表1 不同浓度MCP-1 作用下细胞增殖率 与吸光度值（n=6，±s）Tab1 Effect of different concentrations of MCP-1 on cell proliferation rate and OD Value（n=6，±s）

*P＜0.05 vs control；#P＜0.05 vs MCP-1（75 ng/mL）

Absorbance（OD value）Control 100 0.212 0±0.007 MCP-1（25 ng/mL）151.90* 0.308 0±0.008*MCP-1（50 ng/mL）204.40* 0.414 0±0.010*MCP-1（75 ng/mL）290.50* 0.589 0±0.008* MCP-1（100 ng/mL）276.15* 0.575 0±0.008*MCP-1+PD98059 214.18# 0.451 0±0.007#PD98059 84.83* 0.179 0±0.004*Group Cell proliferation rate（%）

2.2 细胞迁移能力

与对照组（11.34%±1.24%）相比，MCP-1（75 ng/mL）组，A549 细胞迁移率提高（51.33%± 4.21%，P＜0.05）；MCP-1 联 合PD98059 处 理 组 迁移率（28.33%±5.60%）慢于MCP-1 组（P＜0.05）。与MCP-1+PD98059 组相比，PD98059 组（4.50%± 0.70%）迁移率明显减慢（P＜0.05）（图1）。

2.3 细胞侵袭能力

与对照组（115.00±4.05）相比，MCP-1组（545.00± 12.70）穿透细胞数明显增多（P＜0.05）；MCP-1组与MCP-1联合PD98059组（272.00±6.55）相比，细胞侵袭率有所降低（P＜0.05），单用PD9859组细胞侵袭数目（51.00±3.00）降低（P＜0.05）（图2）。

图1 0 h（A1～D1）和48 h（A2～D2）MCP-1 与PD98059 对A549 细胞迁移的影响，普通显微镜，×10Fig1 Effect of MCP-1 and PD98059 on the migration of A549 cells after 0 h（A1-D1）and 48 h（A2-D2）treatment，conventional microscopy，×10

2.4 相关蛋白表达情况

实验结果显示（图3），与对照组相比，加入MCP-1处理后，MMP-14、N-cadherin、MMP-2 及p-ERK 蛋白表达水平增高（P＜0.05），总ERK 蛋白量不变（P＞0.05）；与MCP-1 组比较，PD98059联 合MCP-1 组MMP-14、N-cadherin、MMP-2及p-ERK 蛋白表达水平下降，单用PD98059 组，MMP-14、N-cadherin、MMP-2 及p-ERK 蛋白表达明显下降（P＜0.05）。

3 讨论

图2 MCP-1 和PD98059 对细胞侵袭能力的影响，倒置显微镜，×10Fig2 Effect of MCP-1 and PD98059 on cell invasion，inverted microscope，×10

图3 MCP-1 和PD98059 对N-cadherin、MMP-14、MMP-2、t-ERK、p-ERK 蛋白表达影响Fig3 Effect of MCP-1 and PD98059 on expression of N-cadherin，MMP-14，MMP-2，t-ERK，and p-ERK protein

MCP-1 的异常表达在肿瘤的发生和发展中有着重要的影响，研究显示，MCP-1 在乳腺癌中活化Smad3 和p42/44 MAPK 信号通路促进癌细胞的迁移[7]。在前列腺癌中，MCP-1 激活了包括PKCδ、c-Src 和AP-1 的信号转导途径，抑制该途径特定成分均会降低MCP-1 对细胞侵袭的影响[8]。马钟玲等[9]报道，MCP-1 在NSCLC 组织中的表达高于其在正常组织表达，且与肿瘤的分化、淋巴结是否转移及肿瘤分期有关，提示MCP-1 与NSCLC 的发生发展密切相关。ERK 信号通路可调控各种细胞活动过程（如增殖，存活，分化和运动）等，在人类肿瘤中常被异常激活进而促进肿瘤的侵袭和转移[10]。PD98059 是一种通过作用于其上游激酶而间接抑制ERK1/2 的ERK 抑制剂之一，可阻断外源性的刺激信号转导至胞内，进而影响细胞的生物学效应。

MMPs 是参与肿瘤细胞侵袭和转移的主要蛋白酶家族，当ERK 异常活化，可上调MMP-2、MMP-14 等表达，使细胞外基质降解加快[11]，MMP-14 高表达时可促进MMP-2 的活化分泌，诱导家族其他发挥级联反应，进而加速对基底膜的溶解[12]。Fan 等[5]研究表明，通过抑制ERK 信号通路，能有效减弱EMT 的发生。在滑膜肉瘤细胞中，MMP-14 可诱导EMT增强，使N-cadherin的表达上调，提高侵袭能力[13]。

本研究先按照浓度分组，用MTT 实验筛选出MCP-1 作用于A549 细胞的最佳浓度75 ng/mL，再结合ERK 信号通路抑制剂PD98059，通过MTT实验、划痕实验、Transwell 侵袭实验进一步探究MCP-1 对A549 细胞作用情况。结果显示，与对照组相比，MCP-1 明显促进细胞的增殖、侵袭转移，在应用PD98059 作用后，细胞上述作用减弱，免疫印迹结果显示，在MCP-1 的作用下p-ERK、N-cadherin、MMP-14、MMP-2 蛋白表达水平增加，但总ERK 蛋白表达量不变。而在加入ERK 抑制剂PD98059 作用后，上述蛋白表达量下降，进一步推测N-cadherin、MMP-14、MMP-2 为ERK 下 游 靶蛋白。

综上所述，MCP-1 作用于肺癌A549 细胞，可能通过磷酸化ERK 信号通路，增加了ERK 下游N-cadherin、MMP-14、MMP-2 蛋白的表达，最终促进了肺癌细胞增殖、侵袭转移。本实验是对肺癌侵袭转移研究的初步探讨，希望能为未来预防和治疗肺癌等疾病提供新的作用靶点。