响应曲面法优化贯叶连翘脂溶性成分的超声辅助提取工艺

王 燕，高 洁，周 蕊

(陕西国际商贸学院，陕西 咸阳 712046)

贯叶连翘(HypericumperforatumL.)，又名小贯叶金丝桃圣约翰草(St.John’s wort) ，为藤黄科金丝桃属多年生草本植物，具有抗抑郁、抗病毒、抑菌、止血、止咳、镇痛等功效[1-3]。贯叶连翘全草富含多种有效成分，如双蒽酮类化合物、蒽酚类化合物、黄酮类化合物、脂溶性成分、胡萝卜素、维生素C及鞣质等[4-5]。目前，关于贯叶连翘有效成分的研究主要集中在金丝桃素、黄酮类化合物上[6]，而对其它成分的研究较少，关于贯叶连翘中脂溶性成分的提取研究，尤其是超声辅助法提取贯叶连翘脂溶性成分的研究尚未见报道。

超声辅助提取法是利用超声波产生的强烈振动、空化、搅拌等超声效应的协同作用，提高物质分子的运动频率和速度，加速相互渗透溶解，提高油脂在溶剂中的溶解度，进而提高出油率[7-8]。超声辅助提取法是一种颇具发展潜力的提取技术，已广泛应用于天然药物有效成分的提取。

响应曲面法集统计学、数学建模和计算机科学于一体，是优化天然药物有效成分提取工艺的有效方法，具有实验次数少、可考察因素的交互作用等特点[9-10]。

作者在单因素实验的基础上，采用响应曲面法优化贯叶连翘脂溶性成分的超声辅助提取工艺，以期为深度开发贯叶连翘资源提供实验依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

贯叶连翘，产地陕西，经鉴定为藤黄科金丝桃属(HypericumperforatumL.)的地上部分。

正己烷、无水乙醚、无水乙醇、无水硫酸钠等均为国产分析纯。

FA型电子分析天平，上海恒平科学仪器有限公司；RE-52A型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；超声波清洗仪，昆山超声仪器有限公司。

1.2 贯叶连翘脂溶性成分的提取

贯叶连翘药材预先粉碎，备用。称取一定量的贯叶连翘药材粉末于圆底烧瓶中，加入适量溶剂，连接冷凝回流装置；在超声功率为200 W(实验所选超声设备的最大值)的条件下控制温度，提取贯叶连翘脂溶性成分；提取完成后冷却至室温，过滤，真空浓缩挥发溶剂，得到黄色黏稠油状液体物质；干燥称重，按下式计算脂溶性成分提取率(R)：

式中：m为脂溶性成分质量，g；m0为贯叶连翘药材粉末质量，g。

1.3 提取工艺优化

1.3.1 单因素实验

1.3.1.1 提取溶剂的影响

分别以正己烷、石油醚、乙酸乙酯和乙醚为提取溶剂，在液固比为9∶1(mL∶g，下同)、提取温度为45 ℃、提取时间为40 min的条件下提取贯叶连翘脂溶性成分，考察不同提取溶剂对提取率的影响。

1.3.1.2 液固比的影响

以正己烷为提取溶剂，在液固比分别为3∶1、6∶1、9∶1、12∶1、15∶1，提取温度为45 ℃，提取时间为40 min的条件下提取贯叶连翘脂溶性成分，考察液固比对提取率的影响。

1.3.1.3 提取温度的影响

以正己烷为提取溶剂，在提取温度分别为15 ℃、30 ℃、45 ℃、60 ℃、75 ℃，液固比为9∶1，提取时间为40 min的条件下提取贯叶连翘脂溶性成分，考察提取温度对提取率的影响。

1.3.1.4 提取时间的影响

以正己烷为提取溶剂，在提取时间分别为20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，液固比为9∶1，提取温度为45 ℃的条件下提取贯叶连翘脂溶性成分，考察提取时间对提取率的影响。

1.3.2 响应曲面实验

在单因素实验的基础上，以提取率为考核指标，以提取温度、提取时间、液固比为考察因素，采用响应曲面法优化贯叶连翘脂溶性成分的超声辅助提取工艺。

1.4 数据分析与处理

采用响应曲面软件对数据进行拟合分析和处理，实验数据以平均值±标准误差(mean±SE)表示。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 不同提取溶剂对提取率的影响(图1)

图1 不同提取溶剂对提取率的影响Fig.1 Effect of different extraction solvents on extraction rate

从图1可知，以正己烷、石油醚、乙醚、乙酸乙酯为提取溶剂时，贯叶连翘脂溶性成分提取率分别为7.5%、6.5%、4.3%、5.8%，其中，以正己烷为提取溶剂时的提取率最高。因此，选择正己烷作为提取溶剂。

2.1.2 液固比对提取率的影响(图2)

图2 液固比对提取率的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate

从图2可知，随着液固比的增大，贯叶连翘脂溶性成分提取率逐渐升高，当液固比增大至9∶1时，基本提取完全，提取率达到最高；继续增大液固比，提取率缓慢下降。这是因为，增加提取溶剂用量，超声空化作用逐渐增强，脂溶性成分溶出量增加，提取率相应升高。因此，液固比选择9∶1较为适宜。

2.1.3 提取温度对提取率的影响(图3)

图3 提取温度对提取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate

从图3可知，随着提取温度的升高，提取率先升高后降低，在提取温度为45 ℃时提取率达到最高。这可能是因为，提取温度过高，正己烷挥发过多，导致提取率下降。故，在提取过程中应适时补充正己烷，控制提取温度为45 ℃较为适宜。

2.1.4 提取时间对提取率的影响(图4)

图4 提取时间对提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate

从图4可知，当提取时间由20 min延长至40 min时，贯叶连翘脂溶性成分提取率呈线性快速升高；但继续延长提取时间，提取率变化不大。这是因为，提取过程中随着浓度差引起的扩散力的逐渐增大，脂溶性成分快速溶出，提取率快速升高；当渗透压达到平衡时，脂溶性成分基本被提取完全，提取率不再升高。因此，提取时间选择40 min较为适宜。

2.2 响应曲面实验结果

响应曲面实验的因素与水平见表1，方案设计与结果见表2。

表1响应曲面实验的因素与水平

Tab.1 Factors and levels of response surface methodologies

水平因素A.提取温度/℃B.提取时间/minC.液固比/(mL∶g)-135306∶10 4540 9∶11 55 50 12∶1

表2响应曲面实验方案设计与结果

Tab.2 Design and results of response surface methodologies

实验号A℃BminCmL∶gR实测%R预测%135406∶17.016.92245409∶19.289.01335509∶16.126.244354012∶16.246.315454012∶17.948.12635309∶16.697.02745306∶18.46 9.24855406∶19.038.82945409∶19.319.811045506∶18.449.241155509∶18.939.0112453012∶17.808.2113554012∶18.517.95 1455309∶18.298.621545409∶19.349.45

2.2.1 回归模型方程的建立

以脂溶性成分提取率为响应值，采用Design-Expert 7.1.3软件对表2数据进行回归拟合，得到贯叶连翘脂溶性成分超声辅助提取工艺的多元二次回归方程模型：R=-25.96437+0.98825A+0.39025B+0.71083C+(3.02500E-003)AB+(2.08333E-003)AC+(1.33333E-003)BC-0.011325A2-(6.70000E-003)B2-0.053333C2。

2.2.2 方差分析

对上述模型进行统计学处理，方差分析结果见表3。

表3方差分析

Tab.3 Analysis of variance

实验的标准偏差sd=0.035，表明实验过程误差较小。因此，该模型对贯叶连翘脂溶性成分的提取条件优化是可行的。同时，可以明显看出AC项对响应值有显著影响(P<0.05)，A、C、AB、A2、B2、C2项对响应值有极显著影响(P<0.01)。

2.2.3 响应曲面分析

根据贯叶连翘脂溶性成分超声辅助提取工艺的多元二次回归方程模型绘制的响应曲面图、等高线图如图5所示，响应曲面的方差分析如图6所示。

从图5a可知，当液固比为9∶1时，随着提取温度的升高，贯叶连翘脂溶性成分提取率呈快速上升趋势，随后又出现下降趋势；提取时间对提取率的影响曲线较为平缓；提取温度与提取时间的交互作用对提取率的影响极为显著。提取温度的合适水平范围为43～53 ℃，提取时间的合适水平范围为36～46 min。

从图5b可知，当提取时间为40 min时，液固比、提取温度以及两者交互作用对贯叶连翘脂溶性成分提取率的影响均比较显著。提取温度的合适水平范围为43～53 ℃，液固比的合适水平范围为(6.56～9.69)∶1。

图5 各因素交互作用对提取率影响的响应曲面及等高线图Fig.5 Response surface and contour plots for the interactive effects of each factors on extraction rate

从图5c可知，当提取温度为45 ℃时，液固比对贯叶连翘脂溶性成分提取率的影响较显著；液固比与提取时间的交互作用对提取率的影响不显著。提取时间的合适水平范围为36～46 min、液固比的合适水平范围为(6.56～9.69)∶1。

图6 响应曲面的方差分析图Fig.6 Analysis of variance for response surface

从图6可知，提取率实际测定值和预测值分布几乎在同一直线上(图6a)，提取率测定值与各因素的拟合效果良好(图6b)。因此，该模型能够很好地反映各因素与响应值之间的真实关系，可用于贯叶连翘脂溶性成分的超声辅助提取工艺优化。

2.2.4 最优提取工艺

对模型方程求导计算得到超声辅助提取贯叶连翘脂溶性成分的最优工艺条件为：提取温度47.95 ℃、提取时间41.24 min，此条件下，贯叶连翘脂溶性成分的提取率为9.54%。基于实际操作及经济因素，对工艺参数进行修正，得到最优提取工艺条件为：以正己烷为提取溶剂、超声功率200 W、提取温度48 ℃、提取时间41 min、液固比9∶1(mL∶g)，在此条件下平行3 次实验，得到的提取率为9.45%(相对标准偏差小于1%)。

3 结论

以正己烷为溶剂，采用超声辅助法提取贯叶连翘脂溶性成分，在单因素实验的基础上结合响应曲面法对提取工艺进行优化，得到最优提取工艺条件为：超声功率200 W、提取温度48 ℃、提取时间41 min、液固比9∶1(mL∶g)，在此条件下，贯叶连翘脂溶性成分提取率达到9.45%(相对标准偏差小于1%)。该提取工艺具有设备简单、耗时少、成本低等特点，为贯叶连翘有效成分的进一步研究提供了实验数据。