大丽轮枝菌YMF1.02083的化学成分研究

万 娟,阿 秋，李国红

(云南大学 云南省生物资源保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650091)

大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)属于真菌界的半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、淡色孢科、轮枝菌属[1]。大丽轮枝菌是一种寄主范围广泛的植物病原真菌，也是引起我国棉花黄萎病的主要病原菌，能侵染棉花、甜瓜、向日葵等多种重要的经济作物，对农业生产造成巨大危害[2-3]。目前对大丽轮枝菌代谢产物的研究较少，2010年从该菌中分离到2种新化合物deoxyneofusapyrone和7-desmethyldeoxyneofusapyrone，其中10 μg的deoxyneofusapyrone可抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)临床分离株87-7927的生长[4]。为了对该种真菌的化学成分进行比较全面的了解，作者选取大丽轮枝菌YMF1.02083进行化学成分的研究，从其发酵液的甲醇提取物中分离得到3个化合物，对其结构进行鉴定，并考察化合物的杀线虫活性。

1 实验

1.1 试剂与仪器

所用有机溶剂均为重蒸工业纯试剂。

Sephadex LH-20型柱层析凝胶，Pharmacia公司；200～300目柱层析硅胶、薄层层析(TLC)用硅胶G板，青岛海洋化工厂；Avance Ⅲ 600型超导核磁共振仪；Finnigan LCQ-Advantage型质谱仪。

1.2 菌株与培养基

V.dahliaeYMF1.02083，保藏于云南省生物资源保护与利用重点实验室菌种库。

PDA培养基：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 15 g，蒸馏水1 000 mL，pH值自然。

1.3 菌株的发酵及发酵液的浓缩萃取

菌株V.dahliaeYMF1.02083在PDA培养基上28 ℃活化8 d后，将菌块转接到PDA固体培养基平板上，共30个平板，作为种子，在28 ℃下培养8 d。再将种子菌块接种于PDA培养基平板中，每个9 cm平板装25 mL的培养基，共发酵10 L，置于28 ℃培养箱中培养21 d；菌块切成小块，置于5 L玻璃瓶中，用乙酸乙酯-甲醇-醋酸(800∶150∶50，体积比，下同)浸泡，浸泡液过滤后用旋转蒸发仪在50 ℃下浓缩，再用甲醇溶解得到提取物20.5 g。

1.4 菌株发酵液甲醇提取物的分离

将甲醇提取物20.5 g用等量硅胶拌样，自然风干后过正相柱，石油醚装柱，用石油醚-乙酸乙酯(30∶1、20∶1、10∶1、4∶1、1∶1)洗脱，共得到12个组分(A1～A12)。组分A6(12 mg)过甲醇凝胶柱后得到2个组分A6-1和A6-2，将组分A6-2过硅胶柱(氯仿-丙酮)得到2个组分A6-2-1和A6-2-2，组分A6-2-1通过薄层层析分离得到化合物Ⅰ(3 mg)。组分A10(50 mg)过2次凝胶柱，用甲醇洗脱，得到化合物Ⅱ(34 mg)。组分A11(5 mg)经甲醇凝胶柱反复纯化得到化合物Ⅲ(2 mg)。

1.5 结构鉴定

分别对化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ进行质谱、核磁共振波谱分析，并与文献进行对照，确定其结构。

2 结果与讨论

2.1 化合物的结构表征

化合物Ⅰ：白色粉末。ESI-MS:277[M-H]-；1HNMR(CDCl3,600 MHz),δ:5.37(6H,m),2.77(1H,s),2.36(2H,t,J=7.4 Hz),2.17(2H,m),1.64(2H,m),0.90(3H,t,J=6.4 Hz);13CNMR(CDCl3,150 MHz),δ:178.4(C-1),33.8(C-2,t),24.7(C-3,t),29.5(C-4,t),29.4(C-5,t),29.7(C-6,t),31.5(C-7,t),33.7(C-8,t),130.2(C-9,d),138.0(C-10,d),130.0(C-11,d),129.7(C-12,d),127.9(C-13,d),139.7(C-14,d),31.9(C-15,t),31.8(C-16,t),22.6(C-17,t),14.2(C-18,q)。以上数据与文献[5]报道一致，故确定化合物Ⅰ为(9Z,11E,13E)-9,11,13- octadecatrienoic acid。

化合物Ⅱ：黄色油状物。ESI-MS:137[M-H]-；1HNMR(CDCl3,600 MHz),δ:7.09(2H,d,J=8.4 Hz),6.79(2H,d,J=8.4 Hz),3.83(2H,t,J=6.6 Hz),2.81(2H,t,J=6.6 Hz);13CNMR(CDCl3,150 MHz),δ:154.4(C-4,s),130.2(C-1,s),130.1(C-2/6,s),115.5(C-3/5,s),63.8(C-8,t),38.2(C-7,t)。以上数据与文献[6]报道一致，故确定化合物Ⅱ为4-hydroxy-benzene-ethanol。

化合物Ⅲ：无色固体。ESI-MS:413[M+H]+；1HNMR(CDCl3,500 MHz),δ:5.36(1H,brd,H-7),5.24(2H,m,H-22,H-23),3.62(1H,m,H-3),3.03(1H,d,J=7.2 Hz,H-6)，1.03(3H,s,H-19),0.91(3H,d,J=8.2 Hz,H-21),0.83(3H,t,J=7.1 Hz,H-28),0.81(6H,m，H-26,H-27),0.59(3H,s,H-18);13CNMR(CDCl3,125 MHz),δ:144.0(C-8),135.3(C-22),132.1(C-23),117.5(C-7),76.0(C-5),73.6(C-6),67.7(C-3),55.9(C-17),54.7(C-14),43.7(C-13),43.4(C-9),42.8(C-24),40.4(C-20),39.3(C-12),39.1(C-4),37.0(C-10),33.0(C-25),32.9(C-1),30.8(C-2),27.9(C-16),22.8(C-15),22.0(C-11),21.6(C-21),19.9(C-26),19.6(C-27),18.8(C-19),17.5(C-28),12.3(C-18)。以上数据与文献[7]报道一致，故确定化合物Ⅲ为(3β,5α,6α,22E)-3-hydroxy-5,6-epoxy-7-one-8(14),22-dien-ergosta。

化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的结构式如图1所示。

图1 化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的结构式Fig.1 Structural formulas of compounds Ⅰ,Ⅱ，and Ⅲ

2.2 杀线虫活性的测定

对化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ进行了毒杀秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)活性测定。分别将化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ用适量甲醇溶解，并用无菌水稀释，配制成浓度为200 μg·mL-1的溶液，以等量甲醇作为空白对照，在显微镜下观察线虫死亡情况，记录死亡线虫数和总线虫数，计算校正死亡率。结果表明，化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在浓度为200 μg·mL-1时均无毒杀线虫活性。

3 结论

从大丽轮枝菌(V.dahliae)YMF1.02083发酵液的甲醇提取物中分离得到3个化合物(9Z,11E,13E)-9,11,13-octadecatrienoic acid(Ⅰ)、4-hydroxy-benzene-ethanol(Ⅱ)和(3β,5α,6α,22E)-3-hydroxy-5,6-epoxy-7-one-8(14),22-dien-ergosta(Ⅲ)。这3个化合物在浓度为200 μg·mL-1时，对秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)均无毒杀活性。