百合固金汤止血活性及其促凝机制研究∗

陈宏鹏 黄婉兰 闫 珺 何俊冰△

（1.广东省揭阳市人民医院，广东 揭阳 522000；2.黑龙江中医药大学第一附属医院，黑龙江哈尔滨 150000）

百合固金汤是临床常用的经典方剂，多用于治疗肺肾阴虚的咳喘，亦有医家用其治疗咯血，尤其是以肺阴亏虚或肺肾阴虚为主要病机的咯血，亦能取效［1-3］。既往有报道用于治疗支气管扩张、肺结核、肺癌等导致的咯血，均能发挥止血作用［4-7］，但其止血机制尚不明确。本研究选取小鼠肝脏出血以及断尾出血模型，评价百合固金汤的止血作用，并探讨其止血作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性昆明小鼠，体质量（28±2）g，由北京维通利华实验动物中心提供［合格证号SCXK（京）2016-0006；批号190408276435］。实验期间，所有动物均饲养于同一环境下，保持室温（25±2）℃和空气相对湿度恒定（60±5）%。动物随意进食进水，12 h明暗循环饲养。所有动物于实验前12 h禁食不禁水。

1.2 试药与仪器 戊巴比妥钠，购自国药集团化学试剂有限公司（批号F20160514，纯度≥99%）；白眉蛇毒凝血酶，购自锦州奥鸿制药有限公司（批号H20171206）；凝血酶原时间（PT），凝血酶时间（TT），血浆纤维蛋白原（FIB）和活化部分凝血活酶时间（APTT）试剂盒购自希森美康有限公司，批号分别为STG10101-62，STG10301-35，STY20401-13，ST20201-08）；枸橼酸钠购自天津市永大化学试剂有限公司（批号20180530）；百合固金汤中所有中药材购自北京仟草股份有限公司（百合20 g，熟地黄15 g，生地黄15 g，玄参15 g，白芍5 g，甘草5 g，麦冬20 g，贝母20 g，当归15 g，桔梗5 g）；称取百合固金汤药材130 g，加2 000 mL双蒸水，100℃回流提取2次，每次1 h。合并提取液，减压浓缩干燥。纤溶酶原激活物（t-PA）、纤溶酶原激活物抑制剂（PAI-1）ELISA试剂盒均购自上海将来实业有限公司。CP224C电子天平（北京奥豪斯仪器有限公司）；LG-PABER-Ⅰ型血小板聚集分析仪（北京世帝科学仪器公司）；CA-550全自动凝血分析仪（日本希斯美康）株式会社。

1.3 分组与给药 在肝脏出血和剪尾出血模型实验中，昆明种小鼠40只随机分为5个实验组，分别为生理盐水组（10 mL/kg 0.9%氯化钠溶液）、阳性药组（0.67 KU/kg白眉蛇毒凝血酶）以及百合固金汤高剂量、中剂量、低剂量组（0.5，0.3，0.1 g/kg，注射量均为10 mL/kg），每组8只，皮下给药。在止血作用机制研究中，同样只数的昆明小鼠分为5个实验组，分别为生理盐水组（10 mL/kg 0.9%氯化钠溶液）、阳性药组（0.67 KU/kg白眉蛇毒凝血酶）以及百合固金汤高剂量、中剂量、低剂量组（0.5，0.3，0.1 g/kg，注射量均为10 mL/kg），每组8只，皮下给药。

1.4 造模与指标检测 1）小鼠断尾出血模型出血时间考察：依据文献建立小鼠断尾出血模型［8-9］。给药2 h后，4%戊巴比妥钠麻醉小鼠，5组小鼠在距离其尾部尖端1 cm处剪断。从血液自行溢出时开始计时，每隔30 s用滤纸吸去尾尖流出的血滴1次，直至无血液流出，至出血停止，将此段时间记为出血时间，同时记录实验结果。2）小鼠肝脏损伤出血模型出血时间考察：脏损伤出血模型参照文献报道方法，给药2 h后，4%戊巴比妥钠麻醉小鼠，沿腹部中线剪开腹腔，暴露全部肝脏。用注射器的针头于小鼠肝左叶靠下部垂直进针3 mm，制备小鼠肝脏损伤出血模型［10］。自取出针头后开始计时，之后每隔30 s用裁剪好的湿滤纸片轻触伤口，观察是否有血迹流出。至滤纸片上无血迹出现，同时满足30 s后伤口处依旧不出血，视为出血停止。记录小鼠肝脏止血的时间，并进行分析。3）凝血相关4项指标检测：各组小鼠给药2 h后摘眼球取血，用含有3.2%枸橼酸钠抗凝剂的离心管收集血样。取血完成后，震摇离心管，使抗凝剂与血液混合均匀。血液静置10 min后，3 000 r/mim离心10 min，取上层血浆检测TT、APTT、PT以及FIB 4项指标［11-13］。4）全血中血小板数目检测：各组小鼠给药2 h后，摘眼球取血150 μL，使其血液滴入EDTA抗凝管中，将血液与管中EDTA抗凝剂混合均匀，防止血液发生凝集。利用血小板聚集分析仪检测血小板数目（PLT）［14］。5）纤溶系统t-PA，PAI-1的测定：各组小鼠给药2 h后摘眼球取血，用含有3.2%枸橼酸钠抗凝剂的离心管收集血液，震摇离心管。采用酶联免疫吸附法，按照各个试剂盒说明书操作步骤，测定血浆中反应凝血系统状态的t-PA和PAI-1的含量。

1.5 统计学处理 应用SPSS17.0版统计软件。计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析（ANOVA）进行多组间差异比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 百合固金汤对剪尾及肝损伤出血的止血作用 见表1。与生理盐水组比较，阳性药组，百合固金汤高剂量组、中剂量组、低剂量组均显著缩短了小鼠经断尾后的尾尖出血时间及肝损伤时间，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各组小鼠出血时间比较（min，±s）

表1 各组小鼠出血时间比较（min，±s）

与生理盐水组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01。下同

组别生理盐水组阳性药组百合固金汤高剂量组百合固金汤中剂量组百合固金汤低剂量组n 6 6 6 6 6尾尖出血时间23.27±2.92 2.69±1.12**8.18±0.87**10.11±2.93**15.77±4.07*肝损伤出血时间8.19±0.95 3.00±0.82**4.28±0.76**4.34±0.89**5.61±0.81*

2.2 百合固金汤对凝血相关指标及血小板的影响见表2，表3。PT和TT值在各组之未发现差异。而与生理盐水组相比，百合固金汤高剂量和中剂量干预显著缩短了小鼠的APTT（P＜0.01）。同时，百合固金汤高剂量和中剂量干预显著升高了小鼠血浆中的FIB含量（P＜0.01），低剂量组无明显变化（P＞0.05）。百合固金汤高、中、低剂量给药后均升高了小鼠血液中的血小板含量（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各组小鼠凝血4项指标比较（±s）

表2 各组小鼠凝血4项指标比较（±s）

组别生理盐水组阳性药组百合固金汤高剂量组百合固金汤中剂量组百合固金汤低剂量组n 6 6 6 6 6 PT（s）15.50±0.77 15.21±0.65 14.86±0.45 15.2±0.67 15.01±0.43 TT（s）43.08±1.91 43.13±1.84 42.375±1.61 42.46±2.04 43.34±1.96 APTT（s）18.75±1.11 18.5±1.49 15.13±1.45**16.35±1.24**18.19±1.32 FIB（g/L）2.092±0.078 2.347±0.062**2.360±0.123**2.295±0.042**2.190±0.078

2.3 百合固金汤对纤溶系统测定的影响 见表4。与0.9%氯化钠溶液组比较，百合固金汤高、中、低剂量时均具有显著提高t-PA的活性的作用（P＜0.05），而对PAI-1的影响主要表现为降低（P＜0.05）。

表3 各组小鼠血小板含量比较（g/L，±s）

表3 各组小鼠血小板含量比较（g/L，±s）

组别生理盐水组阳性药组百合固金汤高剂量组百合固金汤中剂量组百合固金汤低剂量组n 6 6 6 6 6 PLT 990.0±81.7 1 201.3±118.1**1 204.5±109.1**1 134.6±107.5*1 144.0±75.4*

表4 各组小鼠t-PA及PAI-1比较（±s）

表4 各组小鼠t-PA及PAI-1比较（±s）

组别生理盐水组阳性药组百合固金汤高剂量组百合固金汤中剂量组百合固金汤低剂量组n 6 6 6 6 6 t-PA（ng/mL）1.62±0.24 1.49±0.17 1.26±0.24*1.15±0.15*1.21±0.18*PAI-1（pg/mL）133.78±27.09 140.12±19.87 158.24±6.27*166.09±11.90*160.50±22.70*

3 讨论

百合固金汤是明代周之干所著《慎斋遗书》中的经典方剂，由熟地黄、生地黄、当归身（各三钱）、白芍、甘草（各一钱）、桔梗、元参（各八分）、贝母、麦冬、百合（各钱半）组成，用治“患背心前胸肺募间热，咳嗽咽痛，咯血，恶寒，手大拇指循白肉际间上肩房至胸前如活烙”的病症。明代罗周彦在《医宗粹言》中进一步阐释道“此皆肺脏先天元阴衰弱，不能御火，以致虚火上炎为患，并以百合固金汤主之”。为百合固金汤治疗肺阴亏虚导致的咯血的理论依据。阴虚血热，迫血妄行，是阴虚咯血的病机根本，肺肾阴亏，肺失肃降，导致咳嗽，是咯血发生和加重的诱因。百合固金汤方中百合、麦冬、贝母养阴清热，润肺止咳，生地黄、熟地黄、玄参滋阴养血，白芍、当归养血柔肝，桔梗载药上行，甘草清热泻火，调和诸药。全方金水同调，一方面补充阴液，滋阴以降火，使虚热消，血方能归肝，治疗咯血的病机根本，另一方面，润肺止咳，去除咯血的诱因，标本同治，故能取效。

现代医学目前针对咯血主要以止血药物对症治疗为主，必要时采取外科手术及介入治疗。现有常用的内科治疗药物有安络血、止血敏、止血芳酸等，上述药物多通过影响血小板系统及纤溶系统发挥止血作用。

本研究结果提示，百合固金汤对小鼠血小板系统及纤溶系统亦有影响。PLT是从骨髓造血组织中成熟的巨核细胞胞质裂解脱落下来的具有生物活性的小块胞质，具有黏附、聚集、释放、收缩及吸附等生理特性，是凝血过程中是非常重要的一环［7］。PLT的活化、黏合性、释放和聚集被认为是血栓形成过程中的重要机制，而血小板计数是影响血小板聚集的重要因素之一［16］。止血药大多是通过升高血小板数量或者是增强血小板的功效从而达到止血的效果。本实验证实，百合固金汤给药组能够明显升髙PLT的数量，从而进一步佐证了其止血作用。

在研究凝血因子的过程中，可以通过TT、PT、APTT以及FIB推测药物可能作用的凝血途径［17］。凝血过程包括内源性凝血通路（内源性）和外源性凝血通路（外源性）。PT与外源性凝血通路的总效率相关，APTT与内源性凝血指标相关。同时，血浆中常见的凝血通路以及促进纤维蛋白转化为纤维蛋白的活性与TT和FIB水平有关［18］。百合固金汤的止血机制研究结果表明，其能显著降低APTT，而对PT和TT无影响，推测百合固金汤主要通过激活内源性凝血通路从而达到止血效果。同时，本次研究还发现百合固金汤具有明显的升高小鼠的FIB的作用，基于这一结果，我们进一步探讨了其对纤维蛋白溶解系统的作用。

纤维蛋白溶解系统在机体的凝血机制中扮演重要角色，其活性的主要指标包括t-PA和PAI-1。t-PA为特异性激活剂，主要作用于组织型纤溶酶原。机体在形成纤维蛋白时，t-PA通过结合到纤维蛋白的表面从而催化促进纤维蛋白溶解。PAI-1则是t-PA的特异性抑制剂，可以与细胞和血液中的t-PA结合，同时可以通过抑制t-PA从而使血浆纤溶酶原转化为纤溶酶。t-PA与PAI-1的动态平衡对机体的凝血系统具有重要的意义［19］。体内的凝血系统与纤溶系统联系紧密、相互依存。本次实验发现，百合固金汤可以显著提高t-PA的活性，并且能够降低PAI-1，从而影响纤溶系统发挥促凝血作用。这一结果表明百合固金汤的止血作用与提高纤溶系统的活性有关，从而阐释了百合固金汤促凝过程与纤溶系统相关的机制，进一步从分子水平上为百合固金汤的止血活性及其治疗咯血机制提供理论依据。