血清miR-18a、miR-19a在老年冠心病并发脑梗死患者中的表达意义

王灵通，陈玮，王燕，汤春光，尹富华

（临海市第二人民医院，浙江 临海 317016）

老年冠心病患者易发生脑梗死（CI）[1]。微小RNA（miRNA）是在多种疾病发展进程中异常表达的RNA小分子，具有临床诊断和评估的价值[2]。冠心病（CHD）发生后，外周血miRNA表达异常。微小RNA-19a（miR-19a）在冠心病患者血清中高表达，并与冠心病患者发生主要心脏不良事件有关[3]。miR-18a、miR-19a与缺血性疾病关系密切，但两者在冠心病并发脑梗死患者血清中的表达意义尚无相关研究。基于此，本研究探讨血清miR-18a、miR-19a在老年冠心病发生脑梗死患者中的表达意义，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2017年11月-2020年4月本院收治老年CHD并发CI患者109例 （CHD并发 CI组），纳入标准：（1）年龄≥60 岁；（2）临床资料齐全；（3）经超声心动图、头颅螺旋CT、冠状动脉造影检查并确诊；排除标准：（1）细菌感染性心内膜炎、慢性风湿性心脏瓣膜病、心肌炎、慢性心力衰竭、先天性心脏病者；（2）合并免疫系统疾病、脑出血、结缔组织病、精神障碍者；（3）合并急慢性感染、恶性肿瘤、脏器功能衰竭者；（4）近期有手术、创伤、冠状动脉旁路移植术病史者；（5）合并中毒性肝炎、脂肪肝、肝病史、胆囊炎、胆石症者；（6）近期服用抗炎、抗血小板凝集、免疫抑制剂患者。选取同期收治的老年单纯冠心病患者113例为CHD组。两组性别、年龄一般资料比较差异均无统计学意义（P>0.05），详见表1。本研究经医院伦理委员会审批通过且患者知情同意。

表1 两组一般资料比较

1.2 方法 纳入影响老年冠心病并发心肌梗死的10个因素，包括性别、年龄、吸烟史、高血压史、高血脂史和糖尿病史以及血清miR-18a、miR-19a、MMP-9、D-D表达水平，采用单因素和Logistic多因素回归分析miR-18a和miR-19a在老年冠心病并发脑梗死患者中的表达意义。

1.2.1 仪器与试剂 TRIzol Reagent购于武汉科昊佳生物科技有限公司（批号：15596-026）；一步法microRNA反转录试剂盒购于北京百奥莱博科技有限公司（批号：MT0005-IDV）；miRNA QPCR Master Mix试剂盒购于上海嵘崴达实业有限公司（批号：600583）；MMP-9检测采用ELISA法，试剂盒（批号：K4427-1）购于孟成科技（上海）有限公司；D-D采用ELISA法，试剂盒购于上海古朵生物科技有限公司（批号：GD-JX0960）。 nanodrop1000微量紫外可见分光光度计购于上海在途生物科技有限公司；StepOne TM采用qRT-PCR，仪购于美国应用生物系统公司（上海）。

1.2.2 样本采集与检测 收集两组清晨空腹外周血6～8mL，静置约40分钟，4℃下转速 10000r/min离心13分钟，取上层血清，分装于无RNA酶的1.5mL冻存管中，于-80℃冰箱中保存，待检。（1）qRT-PCR 法检测血清miR-18a、miR-19a表达。-80℃冰箱中取出血清样本，冰上溶解，按照TRIzol法抽提血清样本总RNA，以N-D 1000紫外分光光度计测定样本总RNA浓度和纯度，A260/A280比值在1.6～2.0范围为合格样本，进行下一步操作。按照一步法microRNA反转录试剂盒说明书将样本总RNA逆转录为cDNA。参照miRNA QPCR Master Mix试剂盒说明书配制扩增反应体系，采用实时荧光定量StepOne TM PCR仪将样本cDNA扩增、检测。miR-18a、miR-19a均以U6为内参，其对应引物序列详见表 2，其相对表达水平用 2-ΔΔCt计算。 （2）采用ELISA法检测血清MMP-9、D-D水平。具体操作步骤及注意事项按照试剂盒说明书进行。

表2 miR-18a、miR-19a及内参U6的引物序列

1.3 统计学处理 采用统计学软件SPSS22.0进行数据分析。正态分布的计量资料以（±s）表示，采用t检验；计数资料以百分率表示，采用χ2检验；采用Logistic回归分析探讨老年冠心病并发脑梗死的影响因素。

2 结果

2.1 单因素分析 纳入影响老年冠心病并发心肌梗死的10个因素中，与CHD组比较，CHD并发CI组血清miR-19a、MMP-9、D-D水平均升高，血清miR-18a表达水平降低，合并高血脂患者比例较高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。详见表3。

表3 老年冠心病患者并发脑梗死风险的单因素分析

2.2 多因素Logistic回归分析 高血脂病史、miR-19a、MMP-9、D-D是老年冠心病并发脑梗死的独立危险因素（P＜0.05），而 miR-18a为保护因素（P＜0.05）。 详见表 4。

表4 老年冠心病患者发生脑梗死的多因素Logistic回归分析

3 讨论

老年冠心病患者易发生脑供血不足，引发脑梗死，造成偏瘫、半身不遂[4]。探讨冠心病并发脑梗死的危险因素并进行临床监控在一定程度上可减少脑梗死的发生。

miRNA可在细胞增殖、凋亡、炎症反应、信号转导、机体代谢、组织分化、个体发育、凝血/纤溶平衡等过程中发挥重要的生物调控作用[5-8]。罗建华等[9]研究显示，血清miR-18a在急性心肌梗死患者中表达异常，其对诊断及评估急性心肌梗死病情具有较好的参考价值。本研究中老年CHD并发CI组血清miR-18a表达水平明显低于CHD组，推测miR-18a作为miRNA的一员，通过调节信号传导、凝血/纤溶平衡、炎症反应，从而在老年冠心病并发脑梗死中起重要作用。

细胞学研究显示，miR-19a在动脉缺血过程及改善缺血引发血流减少的症状中发挥重要调控作用[10]。miR-19a-3p是miR-19a其中一员，其可能与冠心病的发生发展有关[11-12]。此外，miR-19a在急性心肌梗死患者的血清中过表达可能通过靶向磷酸酶-张力蛋白基因而影响缺血再灌注心肌损伤过程，miR-19a有望成为缺血再灌注心肌损伤的临床诊断标志物[13]。以上研究表明，miR-19a可能在缺血性心血管疾病的发生发展中发挥调节作用。本研究中，老年CHD并发CI组血清miR-19a表达水平高于CHD组，分析原因，miR-19a可能通过影响脂蛋白生物合成、缺氧诱导因子激活缺氧反应、转化生长因子β信号通路、脂肪因子信号通路、血管生成、凝血/纤溶平衡等生物学过程[14]，进而在老年冠心病患者并发脑梗死中发挥重要的调节作用。

本研究发现miR-19a是老年冠心病并发脑梗死的独立危险因素（P＜0.05），而miR-18a为保护因素（P＜0.05）。此外，本研究尚发现高血脂史和MMP-9、D-D也是老年冠心病并发脑梗死的危险因素。MMP-9是一种蛋白水解酶，可降解细胞外基质，促进斑块破裂、继发血栓形成，进而促发CHD和CI[14]；D-D是纤溶酶水解交联纤维蛋白产生的降解产物，其作为继发纤溶亢进、血栓形成的有效指标，与CHD、CI凝血、纤溶失衡关系紧密[14-16]。 周华等[14]发现，MMP-9、D-D在急性脑缺血性CI患者中表达均上调，两者可作为急性脑缺血性脑梗死的辅助诊断标志物。根据本研究结果推测，冠心病并发脑梗死后血脑屏障可能被破坏，局部病灶组织MMP-9进入外周循环系统，血清MMP-9水平升高，进而促进血管平滑肌细胞增殖、迁移，引起血管重构、血管内膜增厚，促进冠心病并发脑梗死。此外，冠心病并发脑梗死的损伤脑组织产生的组织因子使机体凝血活性增加，且病灶附近水肿可引起局部压迫性微循环，使机体处于高凝状态，纤溶活性增加，D-D水平升高，从而在冠心病并发脑梗死的血栓过程中起作用[14]。

以上论述表明，动态检测miR-18a、miR-19a水平有利于防治老年冠心病并发脑梗死。