人胎盘滋养细胞胞内双链DNA识别受体的表达模式及其在介导滋养细胞死亡中的作用

滋养细胞不仅是妊娠建立和维持的物质基础，也是母-胎界面特殊的固有免疫细胞，多种妊娠疾病均与滋养细胞功能障碍密切相关。滋养细胞的免疫识别功能使胎盘形成一个高效的免疫学屏障，以抵抗病原微生物子宫内感染和垂直传播[1]。人胎盘绒毛滋养细胞表达多种固有免疫识别受体[2～4]，滋养细胞通过模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR），识别病原微生物的脂多糖、磷壁酸、RNA 或DNA等病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP），进而激活固有免疫应答，限制或清除病原感染，同时诱导高效、特异的适应性免疫反应，发挥重要的免疫屏障功能[5，6]。已有研究指出，滋养细胞可通过TLR3、TLR7/8、RIG-I 识别病原微生物释放的RNA 成分[7，8]，但滋养细胞能否识别病原体来源的双链DNA 尚不明确，其识别后活化的下游信号通路与胎盘免疫学屏障功能的关系仍有待阐明。为深入探讨胎盘滋养细胞在识别胞内双链DNA 和妊娠免疫保护中的作用，本研究以人滋养细胞系为研究对象，探讨滋养细胞中胞内双链DNA识别受体的表达模式，分析滋养细胞感受双链DNA 刺激后的免疫应答反应，为进一步探索病原体DNA-滋养细胞DNA 受体识别信号在妊娠免疫保护中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料人绒毛膜滋养层细胞系HTR-8/SVneo、人绒毛膜癌细胞株JEG3、JAR、BeWo（中国科学院深圳先进技术研究院张键教授、范秀军教授馈赠）；poly（dA：dT）、转染试剂LyoVec以及Nec-1（Necrostatin-1）、z-VAD-fmk[Z-Val-Ala-Asp（OMe）-fluoromethyl ketone] 和Belnacasan（VX-765）（InvivoGen公司）；Trizol试剂（Sigma公司）；RT-PCR试剂（TakaRa 公司）；RT-PCR 引物（上海生工）。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR 检测DNA识别受体表达 为明确人胎盘滋养细胞胞内双链DNA识别受体的表达模式，经半定量PCR 检测分析胞内IFI16、AIM2、DHX9、DHX36、KU70、LRRFIP1 和ZBP1/DAI 基因的表达情况。参照Trizol 试剂说明书提取人滋养细胞系HTR-8/SVneo、JEG3、JAR、BeWo的总RNA，各取2μg 总RNA进行反转录合成cDNA，使用FastStart Universal SYBR Green Master 试剂进行检测，同时以GAPDH 作为内参，相关基因和引物序列见表1。

表1 基因和引物序列

1.2.2 双链DNA 刺激介导滋养细胞死亡 利用人工合成的不同浓度双链DNA 模拟物poly（dA：dT）刺激人绒毛膜癌细胞系JEG3，以相同剂量的LyoVec作为对照，分为6组：空白对照组、LyoVec 对照组、1μg/ml poly（dA：dT）处理组、2μg/ml poly（dA：dT）处理组、5μg/ml poly（dA：dT）处理组和10μg/ml poly（dA：dT）处理组；刺激24h 后，结晶紫染色实验和MTT 法检测JEG3 细胞活性。为明确双链DNA 诱导的滋养细胞死亡方式，首先分别利用细胞凋亡抑制剂z-VAD-fmk（25μM）、细胞焦亡抑制剂VX-765（10μM）或程序性坏死抑制剂Nec-1（25μM）预先处理JEG3 细胞1h，随后转染5μg/ml的poly（dA：dT）诱导24h 后MTT 法检测细胞存活情况。

1.2.3 MTT 法检测细胞活性 待检测细胞经过分组后，每孔分别加入20μl MTT 溶液，继续培养4h 后终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μl DMSO，充分振荡10min，以空白对照孔调零，酶联免疫检测仪490nm 波长处测量各孔的吸光值（OD值）。

1.3 统计学方法采用SPSS 19.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，组内比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 滋养细胞表达多种胞内双链DNA识别受体RT-PCR 结果表明，4 株滋养细胞系HTR-8/SVneo、JEG3、JAR、BeWo 均可检测到IFI16、AIM2、DHX9、DHX36、KU70 和LRRFIP1 mRNA的表达，但未检测到ZBP1/DAI的基因表达，见图1。

图1 滋养细胞胞内双链DNA识别受体的表达模式

2.2 胞内双链DNA刺激可诱导滋养细胞死亡利用MTT实验检测细胞存活情况，结果显示1μg/ml poly（dA：dT）不影响滋养细胞的存活；2μg/ml、5μg/ml 和10μg/ml的poly（dA：dT）可显著促进滋养细胞死亡，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。结果表明人胎盘绒毛滋养细胞能够感受胞内双链DNA 刺激并介导免疫应答反应，同时胞内双链DNA 能够以剂量依赖的方式诱导滋养细胞死亡。

图2 MTT实验检测细胞存活情况

2.3 滋养细胞感受胞内双链DNA刺激后介导多种程序性细胞死亡 结果显示，Nec-1 对poly（dA：dT）诱导的滋养细胞死亡无明显影响（P＞0.05）；z-VADfmk 和VX-765 处理能够显著抑制poly（dA：dT）诱导的滋养细胞死亡，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。结果表明双链DNA 诱导滋养细胞发生细胞凋亡和细胞焦亡，但不介导程序性坏死。

图3 poly（dA：dT）联合程序性细胞死亡特异性抑制剂对JEG3 细胞的影响

3 讨论

在母-胎界面，胎盘对病原体感染的固有免疫反应是通过PRRs 识别病原体源性成分而启动的。不同的病原相关分子模式被识别后产生的信号级联反应，因参与的模式识别、组织分布和细胞类型不同而产生不同的宿主免疫应答[9]。已知胎盘滋养细胞表达TLR1-10 受体[10]、NLRP3[11]、NOD1 和NOD2[12]等多种固有免疫识别受体，本研究进一步明确了滋养细胞表达包括IFI16、AIM2、DHX9、DHX36、KU70 和LRRFIP1 在内的多种胞内双链DNA识别受体。机体被病原体感染后可激活固有免疫系统和适应性免疫系统，从而活化NF-κB 或I型干扰素信号[13]，介导炎症反应或促进被感染细胞死亡，以限制或清除病原体感染[14]。本研究证实了滋养细胞感受胞内双链DNA 刺激后能够诱导免疫应答反应，并以剂量依赖的方式诱导细胞死亡。

固有免疫系统作为机体抵御病原微生物入侵的第一道防线，通过模式识别受体识别病原相关分子模式后，可诱导被感染细胞发生程序性死亡，这种主动的细胞死亡被认为对病原体是有害的，是机体对病原体感染的一种免疫防御机制[15]。细胞凋亡是伴随Caspase 活化的程序性细胞死亡，细胞凋亡时维持膜的完整性，不会迅速释放胞内物质，细胞解体前被吞噬细胞吞噬，通常不引起炎症反应；此外，细胞凋亡介导的吞噬作用刺激机体产生白介素10（IL-10）和转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）以抑制炎症反应，因此一般认为细胞凋亡是维持细胞稳态所需的免疫沉默过程，对机体是有益的。细胞焦亡通常由炎性小体所介导，模式识别受体（如NLRP3、AIM2 等）识别病原相关分子模式或损伤相关分子模式后，通过接头蛋白ASC（apoptosis-associated speck-like protein contain a CARD）招募半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶酶原（pro-Caspase-1），当pro-Caspase-1的局部浓度升高时，发生自体剪切，生成具有生物活性的Caspase-1[16，17]。 Caspase-1 可剪切细胞因子pro-IL-1β和pro-IL-18，使其成熟并释放到胞外介导炎症反应，表现为细胞膜崩解，胞质内毒素释放，趋化炎症细胞促进其释放细胞因子，启动宿主免疫反应，也是机体重要的固有免疫反应，在抵抗病原感染和内源危险信号中发挥重要作用。

程序性坏死是近年来新发现的一种细胞死亡方式，受体相互作用蛋白激酶1（RIP1）去除泛素化修饰后，以FADD 作为桥梁与Caspase-8 和RIP3 形成胞内多蛋白复合体，当Caspase-8 活化时诱导细胞发生凋亡；而当Caspase-8 活化障碍时，RIPK1 和RIPK3 清除障碍并磷酸化，导致坏死体形成增加，从而导致细胞发生程序性坏死。与细胞凋亡和焦亡相比，程序性坏死没有Caspase 活化，不形成凋亡小体并且呈现坏死样结构[18]。细胞程序性坏死导致细胞膜完整性丧失，释放的胞内物质使PRRs对PAMPs 敏感性升高，促进炎症反应和感染性疾病的恶化，显示出细胞死亡有害的一面[19]。本研究证实人工合成的双链DNA 模拟物刺激滋养细胞系JEG3 后所介导的细胞死亡，可被Caspase 抑制剂z-VAD-fmk 和Caspase-1 特异性抑制剂部分逆转，但此细胞死亡方式不受程序性坏死特异性抑制剂Nec-1 影响。Nec-1 作用于RIP1 激酶活性，能特异性地阻断非Caspase 依赖的细胞死亡，对细胞凋亡和细胞焦亡没有抑制作用。

综上所述，滋养细胞胞内表达多种双链DNA感受器，外界的DNA 刺激滋养细胞后主要介导的细胞死亡方式是Caspase 依赖的细胞凋亡和细胞焦亡，并不诱导细胞发生程序性坏死。子宫内感染过程中病原来源的双链DNA 可作为病原相关分子模式被胞内双链DNA识别受体识别，进而激活固有免疫应答，诱导细胞死亡，限制或清除病原感染，以抵御病原微生物入侵。因此，深入探讨胎盘滋养细胞双链DNA识别的活化机制，将有助于揭示病原体DNA-滋养细胞DNA 受体识别信号在妊娠免疫保护中抵抗病原微生物子宫内感染和垂直传播的作用。