肾炎康复片对糖尿病大鼠肾组织BMP-7、TGF-β1及Smad1表达的影响

糖尿病肾病是慢性肾病的常见类型，是新增维持性血液透析患者的主要病因。研究表明，转化生长因子-β（TGF-β）/骨形态蛋白-7（BMP-7）/Smad信号通路在肾脏疾病进程中发挥着关键作用[1]，这些细胞因子作为糖尿病肾病早期识别和风险预测指标、潜在治疗靶点和判断保护肾脏治疗的疗效指标已备受关注[2，3]。临床和动物实验研究显示，肾炎康复片可改善糖尿病患者和糖尿病大鼠肾功能，但具体机制尚不清楚[4，5]。本研究通过观察肾炎康复片对糖尿病大鼠肾组织BMP-7、TGF-β1及Smad1 表达的影响，探讨肾炎康复片对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料清洁级雄性SD 大鼠34只，6周龄，体重180～220g，购自浙江省实验动物中心，许可证号：SCXK 浙20080033。肾炎康复片（天津同仁堂股份有限公司，国药准字Z10940034）；链脲佐菌素（STZ，美国Sigma 公司），免疫组化H2O2-氨基联苯胺（DAB）试剂盒、链霉亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物工作液、兔抗大鼠BMP-7 多克隆抗体、兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体、兔抗大鼠Smad1多克隆抗体、磷酸盐缓冲液（PBS）、柠檬酸盐缓冲液、生物素化山羊抗兔IgG（购自武汉博士德生物技术有限公司）。

1.2 模型制备、分组与给药大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常对照组（NC组）10只和造模组24只。所有大鼠均禁食（不禁水）12h 后，造模组大鼠于腹腔一次性注射1% STZ 60mg/kg（以pH 4.2的0.1mol/L 柠檬酸缓冲液配制），NC组大鼠腹腔注射相当剂量的柠檬酸缓冲液作为对照。72h 后经大鼠尾静脉采血测血糖（罗氏卓越型血糖仪），随机血糖≥16.7mmol/L 者视为造模成功。将造模成功大鼠随机分为糖尿病模型组（DM组）和肾炎康复片干预组（SYK组），各12只。SYK组以肾炎康复片600mg·kg-1·d-1的剂量（溶于生理盐水）灌胃给药，NC组与DM组大鼠给予相当剂量生理盐水灌胃，连续干预8周。

1.3 标本收集大鼠处死前1 天用代谢笼收集大鼠24h 尿液，用于测定尿蛋白（Upro）含量。20%乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠后行心脏取血，收集血浆于-20℃冰箱保存待测血糖（BG）、血肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）。摘取大鼠肾脏，滤纸吸干血迹后，取部分肾组织置于10%甲醛溶液中固定，留作光镜和免疫组化检测。

1.4 肾脏病理形态学观察及肾组织BMP-7、TGF-β1、Smad1 免疫组化检测常规脱水，石蜡包埋，制成4μm 厚度切片，行HE 染色。光镜下观察肾组织的形态结构。HE 染色切片高倍镜下（×400）随机选择10个肾小球区视野，采用Image-Pro Plus 6.0 病理图像分析软件测量肾小球平均截面积（MGA），根据公式：肾小球平均体积（MGV）=1.25×MGA3/2，计算MGV。采用SABC 法检测肾组织BMP-7、TGF-β1、Smad1的表达，阳性反应为胞浆呈棕黄色着色，高倍镜下（×400）测量肾小球BMP-7、TGF-β1、Smad1的表达，以灰度值表示，数值越小表示染色越深，阳性强度越高，每组随机测定10个肾小球区视野，以均值作为该组的结果。

1.5 统计学方法采用SPSS 17.0 软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肾组织病理学变化比较HE 染色光镜下观察，NC组肾小球未见病理改变。DM组可见肾小球结构破坏，毛细血管管壁增厚，管腔狭窄，肾小球系膜区增宽。SYK组肾小球情况较DM组有所改善，肾小球系膜区增厚程度减轻，毛细血管管壁变薄，管腔开放，见图1。

图1 光镜下各组大鼠肾组织病理学变化（HE 染色，×400）

2.2 各组大鼠生化指标、体重、平均肾小球体积比较干预8周末DM组和SYK组大鼠均死亡2只。DM组BG、Scr、BUN、Upro、尿量、MGA、MGV均高于NC组，但体重低于NC组（P＜0.05）；SYK组Scr、BUN、Upro、尿量、MGA、MGV均明显低于DM组（P＜0.05），但仍高于NC组（P＜0.05）；SYK组体重大于DM组、小于NC组（P＜0.05），SYK组与DM组间血糖差异无统计学意义（P＞0.05），见表1、2。

2.3 各组大鼠BMP-7、TGF-β1、Smad1表达比较与NC组相比，DM组和SYK组大鼠肾小球BMP-7的表达明显降低，其灰度值升高，差异均有统计学意义（P＜0.05），而TGF-β1、Smad1的表达明显升高，其灰度值降低（P＜0.05）。与DM组比较，SYK组大鼠肾小球BMP-7 蛋白表达升高，其灰度值降低（P＜0.05），TGF-β1、Smad1的表达明显降低，其灰度值升高（P＜0.05），见表3、图2～4。

表1 各组大鼠体重、BG、Scr 和BUN 比较（±s）

表1 各组大鼠体重、BG、Scr 和BUN 比较（±s）

注：与NC组比较，*P＜0.05；与DM组比较，△P＜0.05

组别只数 体重（g） BG（mmol/L） Scr（μmol/L） BUN（mmol/L）NC组 10 459.00±55.97 8.80±0.77 33.30±6.23 6.26±0.93 DM组 10 206.00±41.35* 28.55±3.09* 55.10±9.57* 16.48±2.66*SYK组 10 245.00±36.82*△ 26.75±3.94* 40.40±6.67*△ 11.94±1.92*△

表2 各组大鼠Upro、MGA、MGV 和尿量比较（±s）

表2 各组大鼠Upro、MGA、MGV 和尿量比较（±s）

注：与NC组比较，*P＜0.05；与DM组比较，△P＜0.05

组别只数 Upro（mg/24h） MGA（×103μm2） MGV（×105μm3） 尿量（ml/24h）NC组 10 7.55±1.35 9.29±0.78 11.20±1.42 14.50±3.24 DM组 10 56.90±9.22* 13.76±0.36* 20.18±0.80* 221.00±17.13*SYK组 10 30.42±7.78*△ 11.64±1.00*△ 15.74±2.02*△ 137.00±16.02*△

表3 各组大鼠肾组织BMP-7、TGF-β1 和Smad1 灰度值 比较（±s）

表3 各组大鼠肾组织BMP-7、TGF-β1 和Smad1 灰度值 比较（±s）

注：与NC组比较，*P＜0.05；与DM组比较，△P＜0.05

组别只数 BMP-7 TGF-β1 Smad1 NC组 10 133.49±5.47 162.89±6.87 159.27±10.06 DM组 10 161.51±4.72* 128.03±8.49* 128.48±8.13*SYK组 10 146.06±1.63*△ 142.24±5.71*△ 140.98±5.15*△

图2 各组大鼠肾组织BMP-7的表达（免疫组化，×400）

图3 各组大鼠肾组织TGF-β1的表达（免疫组化，×400）

图4 各组大鼠肾组织Smad1的表达（免疫组化，×400）

3 讨论

肾炎康复片主要由白花蛇舌草、西洋参、益母草等10 余种药物组成，具有益气养阴、健脾补肾、增强免疫、活血化瘀等功效。本研究显示，8周末STZ 诱导的DM组大鼠较NC组血肌酐、尿素氮、尿蛋白显著升高，尿量明显增多、体重下降；肾脏病理显示肾小球毛细血管管壁增厚，管腔狭窄，肾小球系膜区增宽，MGA 及MGV 增大。SYK组大鼠上述生化指标均明显改善，肾脏病理学变化明显减轻，提示肾炎康复片对糖尿病大鼠肾脏具有保护作用。

TGF-β1是导致肾脏纤维化的主要细胞因子。高糖环境下，TGF-β1和肾小球系膜细胞葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）表达上调，且两者相互促进，致系膜细胞葡萄糖转运能力增强和系膜细胞外基质积聚，促进肾小球硬化[6]。高血糖还可以通过TGF-β活化激酶1 信号通路诱导巨噬细胞活化和炎症反应，参与糖尿病肾病的进展[7]。BMP-7 和TGF-β1同属于转化生长因子超家族，BMP-7 是具有阻断TGF-β1诱导的促纤维化作用的细胞保护因子；给予外源性BMP-7 或诱导内源性BMP-7 过度表达，能够减少高血糖和TGF-β1诱导的足细胞凋亡，保护足细胞数量和完整性，抑制糖尿病大鼠肾脏纤维化进程，改善肾功能[8，9]。

Smad是介导BMP-7/TGF-β1信号传导的胞内蛋白，Smad 蛋白复合物的磷酸化（p-Smads）受BMP-7 和TGF-β1共同调节[10]。研究发现，STZ 诱导的糖尿病大鼠肾小球中Smad1 和p-Smads的表达显著升高，Smad1 直接参与Ⅳ型胶原蛋白（Col-Ⅳ）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达调节，肾小球Smad1的表达和尿Smad1 水平与肾小球Col-Ⅳ和α-SMA的表达、系膜区基质扩张呈显著正相关，而尿白蛋白和肾小球滤过率与系膜区基质扩张无关[3，11]，提示尿Smad1 水平较尿白蛋白可更好地作为糖尿病肾病早期诊断标记物，也是迟发肾小球硬化的新型预测指标。

本研究显示8周末DM组大鼠肾组织TGF-β1、Smad1的表达明显高于NC组，而BMP-7的表达明显降低，与既往研究结果相似[8，11]，提示DM组大鼠肾脏存在促纤维化细胞因子表达增强。与DM组比较，SYK组大鼠肾组织TGF-β1、Smad1的表达明显降低，BMP-7的表达升高，差异具有统计学意义，提示肾炎康复片可以通过促进BMP-7 表达和抑制TGF-β1、Smad1 表达，改善DM 大鼠肾脏促纤维化和抗纤维化细胞因子表达失衡，延缓糖尿病肾脏损害，为临床应用提供了理论依据。