前列腺癌组织miR-802、RAB23表达变化及其与患者临床病理特征和预后的关系

胡争，李先林，瞿曦，马进华，张志蓓

1 湖北省第三人民医院，武汉430000；2 湖北省荣军医院

前列腺癌是中老年男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一。中国癌症统计数据显示，2015年前列腺癌的预期发病率和病死率分别为6.03/10万例、2.66/10万例[1，2]。前列腺癌早期常无明显症状，大多数患者发现时已处于中晚期。内分泌治疗是进展期前列腺癌首选的治疗方式。但对于晚期转移性前列腺癌或去势抵抗前列腺癌，内分泌治疗效果较差[3]。目前，前列腺癌发病的确切分子机制尚不清楚。因此，深入研究与前列腺癌发生、发展相关的分子，对其早期诊断和靶向治疗具有重要意义。微小RNA(miRNA)是真核细胞中的一类内源性非编码RNA，长度18～25个核苷酸，虽然不具备编码蛋白质的功能，但可与靶基因mRNA的3′非翻译区结合，通过改变mRNA的稳定性，调控下游靶基因表达。近年研究发现，在恶性肿瘤中存在多种miRNA异常表达现象，其异常表达与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡等生物学行为密切相关[4]。miR-802是miRNA家族成员之一，定位于人染色体21q22.12。有研究发现，乳腺癌细胞miR-802表达降低，上调miR-802表达可通过抑制FoxM1表达发挥抗肿瘤作用[5，6]。RAB23是RAS原癌基因成员，定位于人染色体6p12.1。RAB23的编码产物为RAS超家族的小GTP结合蛋白，能够参与细胞内膜运输，包括自噬和细菌感染免疫反应相关多种细胞功能的调节。有研究发现，RAB23高表达能够促进肿瘤细胞的浸润和迁移能力[7]。有研究还发现，RAB23是miR-802的生物学靶点，miR-802能够在转录后水平抑制RAB23表达，从而促进胃癌的恶性进展[8]。但目前二者表达变化与前列腺癌发生、发展的关系尚不清楚。为此，本研究观察了前列腺癌组织miR-802、RAB23表达变化，并探讨其在前列腺癌发生、发展中的作用。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年1月～2016年1月湖北省第三人民医院收治的前列腺癌患者80例。所有患者经术后组织病理检查明确诊断。纳入标准：①符合前列腺癌诊断，病理类型为腺癌；②初诊；③接受前列腺癌根治术或肿瘤细胞减灭术；④既往未接受任何抗肿瘤治疗；⑤临床病理资料和随访资料完整。排除标准：①非前列腺腺癌者；②合并泌尿生殖系统、呼吸系统等感染性疾病者；③合并其他器官或系统恶性肿瘤者；④合并心、肝、肺、肾等重要脏器严重功能不全者。患者年龄42～78(55.24±7.1)岁，其中≤65岁31岁、>65岁49例；Gleason评分：<7分36例，≥7分44例；组织分化程度：高中分化39例，低未分化41例；初始前列腺特异性抗原(PSA)水平：≤10 ng/mL 24例，>10 ng/mL 56例；临床分期[9]：Ⅰ、Ⅱ期58例，Ⅲ、Ⅳ期22例；有远处转移16例，无远处转移64例。本研究经湖北省第三人民医院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意。

1.2 miR-802、RAB23表达检测 采用RT-qPCR技术。收集术中切除的前列腺癌组织及其配对的癌旁正常组织(距肿瘤组织边缘>1 cm并经组织病理检查证实为正常前列腺组织)，置于冻存管中，液氮转运至-80 ℃冰箱保存，待组织成批。取前列腺癌组织与癌旁正常组织各约100 mg，采用TRIzol法提取组织总RNA，经紫外分光光度计鉴定，提取的总RNA浓度和纯度合格，可用于后续实验。按TaqMan miRNA反转录试剂盒说明将总RNA反转录为cDNA。反转录条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。以cDNA为模板，分别按SYBR Premix Ex Taq试剂盒和mirVanaTMmiRNA分离试剂盒说明进行PCR扩增。所有引物由上海吉凯基因化学技术有限公司设计合成。引物序列：miR-802上游引物5′-GGACCACCGCTCGCTCATCGCTAA-3′、下游引物5′-TCGCGTTACTATATGCCAAGCCCTAG-3′，内参U6上游引物5′-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3′、下游引物3′-GTGCAGGGTCCGAGGT-5′；RAB23上游引物5′-GGGGTACCCCAGATGTTTTGGGAGGAAAAC-3′、下游引物5′-GAAGATCTTCATCTAAAATGGCAAAGAGAA-3′，内参GAPDH上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′、下游引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。miR-802 PCR反应体系共20 μL：cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，DEPC水7 μL；反应条件：95 ℃ 15 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 15 s、70 ℃ 30 s共40个循环。RAB23 PCR反应体系共20 μL：cDNA模板1 μL，Taq DNA聚合酶0.125 μL，上下游引物各1 μL，20×SYBR Green 1 μL，25 mmol/L dNTPs 1 μL，DEPC水补足至20 μL；反应条件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3 随访 所有患者自出院后采用门诊、电话等形式随访，1～3个月随访1次，随访截至2019年1月，终点事件为患者死亡，统计患者生存情况，计算3年总体生存率。

2 结果

2.1 前列腺癌组织与癌旁正常组织miR-802、RAB23表达比较 前列腺癌组织与癌旁正常组织miR-802相对表达量分别为1.230±0.246、1.731±0.215，RAB23相对表达量分别为1.041±0.210、0.467±0.118。前列腺癌组织miR-802相对表达量低于癌旁正常组织，RAB23相对表达量高于癌旁正常组织(t分别为13.716、21.313，P均<0.05)。

2.2 前列腺癌组织miR-802表达与RAB23表达的关系 Pearson线性相关分析显示，前列腺癌组织miR-802相对表达量与RAB23相对表达量呈负相关关系(r=-0.626，P<0.05)。

2.3 前列腺癌组织miR-802、RAB23表达与患者临床病理特征的关系 见表1。

表1 前列腺癌组织miR-802、RAB23表达与患者临床病理特征的关系

2.4 不同miR-802、RAB23表达与前列腺癌患者预后的关系 截至随访日期，共随访3～48个月、中位随访时间32个月，随访期间死亡46例，无失访。

以前列腺癌组织miR-802相对表达量的均数1.226为临界值，将患者分为miR-802高表达者38例、低表达者42例。miR-802高表达者3年总体生存率为65.8%(25/38)，miR-802低表达者为50.0%(21/42)。miR-802高表达者3年总体生存率与miR-802低表达者比较差异无统计学意义(χ2=3.214，P>0.05)。

以前列腺癌组织RAB23相对表达量的均数1.045为临界值，将患者分为RAB23高表达者44例、低表达者36例。RAB23高表达者3年总体生存率为36.4%(19/44)，RAB23低表达者为75.0%(27/36)。RAB23高表达者3年总体生存率低于RAB23低表达者(χ2=4.861，P<0.05)。

3 讨论

前列腺癌是中老年男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一。近年来前列腺癌的发病率不断升高，已成为威胁男性健康的第二大恶性肿瘤。前列腺癌早期通过根治性手术或根治性放疗等手段，可达到较好的治疗效果，甚至治愈[10]。由于前列腺癌早期常无明显症状，大多数患者发现时已处于中晚期，内分泌治疗成为其首选的治疗方式。但对于晚期转移性前列腺癌或去势抵抗前列腺癌，内分泌治疗效果较差[3]。因此，深入探索与前列腺癌发生、发展相关的分子，对其早期诊断和靶向治疗具有重要意义。

miRNA是一种内源性单链小分子RNA，主要参与基因转录后调控，在多细胞生物的发育过程中发挥重要作用。研究证实，在肝癌、前列腺癌等恶性肿瘤中存在miRNA异常表达现象，通过检测组织或血清miRNA表达有助于肿瘤的早期诊断[11]。miR-802是miRNA家族成员之一，定位于人染色体21q22.12。miR-802可参与构成RNA诱导的沉默复合物(RISC)，而RISC能够通过不完全碱基配对的方式识别靶mRNA，导致靶mRNA的翻译抑制或去稳定化[12]。研究表明，miR-802在舌鳞癌、肝癌等恶性肿瘤中存在表达下调现象，其异常表达可引起其靶基因MAP2K4表达升高，从而导致肿瘤恶性进展[13]。RAB23是RAS原癌基因成员，定位于人染色体6p12.1。RAB23的编码产物为RAS超家族的小GTP结合蛋白，通过促进囊泡运输和控制溶酶体内吞等参与细胞内膜运输。有研究报道，RAB23可通过整合素β1/Rac1信号途径促进鳞癌细胞侵袭和迁移[7]。有研究还发现，RAB23是miR-802的生物学靶点，miR-802能够在转录后水平抑制RAB23表达，从而促进胃癌的恶性进展[8]。但目前二者表达变化与前列腺癌发生、发展的关系尚不清楚。

本研究结果发现，前列腺癌组织miR-802相对表达量低于癌旁正常组织，其表达下调一方面可能与miR-802基因位点的杂合性缺失有关，一方面可能与miR-802基因的甲基化、乙酰化等表观遗传学修饰有关[14]。本研究结果显示，前列腺癌组织miR-802相对表达量与Gleason评分、临床分期有关，而与年龄、初始PSA水平、组织分化程度和远处转移无关，提示miR-802有可能参与前列腺癌的恶性进展，其机制可能与miR-802对靶基因Flotillin-2抑制作用降低，导致Flotillin-2表达增加，进而促进肿瘤细胞上皮间质转化，最终导致肿瘤恶性进展[15]。本研究进一步分析了不同miR-802表达与前列腺癌患者预后的关系，结果发现miR-802高表达者3年总体生存率与miR-802低表达者比较差异无统计学意义，表明miR-802并非影响前列腺癌患者预后的关键因素。这可能与本研究随访时间较短有关。此外，肿瘤的发生、发展过程中存在多种miRNA异常表达现象，一种癌基因可同时受多种miRNA调控，而同一种miRNA亦能调控多种靶基因，从而形成复杂的miRNA调控网络[16]。

RAB23是Hedgehog信号途径重要的负性调节因子。RAB23表达增加可诱导细胞G1期阻滞，从而导致肿瘤细胞凋亡减少。RAB23表达还能促进Gli1、Gli2表达，从而促进肿瘤细胞增殖[17]。有研究表明，RAB23在肝癌、胃癌等恶性肿瘤细胞中表达升高，沉默RAB23表达后肿瘤细胞的侵袭和迁移能力明显下降[18]。有学者通过TargetScan对miR-802的靶点进行预测，结果发现RAB23是miR-802潜在的作用靶点，进一步通过荧光素酶报告基因实验验证RAB23是miR-802的直接作用靶基因，通过siRNA技术敲除miR-802表达后，RAB23表达降低[8]。本研究结果发现，前列腺癌组织RAB23相对表达量高于癌旁正常组织；相关分析发现，前列腺癌组织RAB23相对表达量与miR-802相对表达量呈负相关关系。提示miR-802表达下降能够通过促进RAB23表达增加，从而促进前列腺癌的发生、发展。本研究结果发现，前列腺癌组织RAB23相对表达量与Gleason评分、临床分期有关，而与年龄、初始PSA水平、组织分化程度和远处转移无关。提示RAB23可能参与前列腺癌的恶性进展，其机制可能是RAB23对Hedgehog信号途径的抑制作用减弱，从而促进肿瘤的局部浸润和远处转移。此外，RAB23还可直接促进转移相关因子Rac1表达，从而促进前列腺癌转移[19]。本研究还发现，RAB23高表达者3年总体生存率低于RAB23低表达者，提示RAB23高表达与前列腺癌患者预后不良有关。因此，RAB23有可能成为评估前列腺癌患者预后的分子生物标志物。

综上所述，前列腺癌组织miR-802低表达、RAB23高表达，二者表达变化与前列腺癌的发生、发展和患者预后有关。miR-802、RAB23有望成为前列腺癌早期诊断、靶向治疗和预后评估的分子生物标志物。