胃癌组织中SPAG5的表达及意义

葛柯乐，方成，燕海娇，袁青玲，陈文玉，王琦，吴骏

苏州大学附属第三医院，江苏常州 213003

胃癌是一种异质性、多因素的疾病，是常见的恶性肿瘤之一。早期胃癌症状不典型，大多数患者确诊时已是胃癌晚期，预后差，病死率高[1]。因此，迫切需要探寻出新的诊断方法和准确评估患者预后的标志物，这对临床研究及患者的治疗具有重要的指导意义。2001年，驱动蛋白家族成员精子相关抗原5(SPAG5)被首次发现，其也称为有丝分裂纺锤体相关蛋白5[2,3]。SPAG5作为纺锤体结合蛋白之一，在有丝分裂S期通过C-未端序列结合于纺锤体，在细胞周期M期表达升高，调控有丝分裂中纺锤体的装配时间及姐妹染色体分离，主要表达于精原细胞，在胃、肠、肝脏等正常组织中低表达[4～7]。SPAG5表达的高低与细胞的增殖状态密切相关，下调细胞的SPAG5蛋白表达，将形成多级异常纺锤体，致使分裂停止[8,9]。已有相关研究[10～12]表明，SPAG5具有促进细胞增殖，抑制细胞凋亡的作用。近年来发现，SPAG5参与肿瘤的发生发展，在宫颈癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、肝细胞癌及膀胱癌中SPAG5表达量增加，且其过表达与患者不利的预后相关[10,12～14]。提示SPAG5可能是参与癌症发生发展过程中的重要致癌基因，可视为潜在的治疗靶点。SPAG5在胃癌中的作用尚不清楚，本项研究旨在检测SPAG5在胃癌组织中的表达变化，同时分析其与患者临床病理特征的关系，明确SPAG5在胃癌患者中预后价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾性收集2015年9月～2017年3月在常州市第一人民医院行胃癌根治术的41例患者的临床资料。其中，男30例、女11例，年龄30～73岁、中位年龄61岁。所有病例为经手术治疗的初诊患者，术后经2名以上病理学专家确诊，并按照WHO胃癌组织学分类和分级标准进行胃癌分期的判定。纳入标准：①术后切除标本经病理诊断证实为胃癌；②临床病例资料完整，随访数据准确。排除标准：①合并其他原发肿瘤；②合并其他影响胃癌预后的疾病或因素。术后标本取出后部分保存于液氮中，部分用10%多聚甲醛固定并包埋在石蜡中。

同时，从上海芯超生物有限公司购买胃癌组织芯片(HStm-A180Su-11)。芯片中包含180例芯点(90例癌组织和与之匹配的90例癌旁组织)。组织来源患者中男61例、女29例，中位年龄65.5岁。所有患者术前均未接受放射或化学等其他治疗，芯片中所有组织经病理专家读片确诊为胃癌。胃癌TNM分期采用美国癌症联合委员会(AJCC)和国际抗癌联盟(UICC)TNM分期系统(2010年第七版)。

1.2 SPAG5 mRNA检测 采用实时荧光定量PCR。利用TRIzol试剂(Invitrogen)提取组织样本中的总RNA，紫外分光光度仪测定260、280 nm吸光度值，计算RNA含量。根据PrimeScriptTMRT(Clontech Laboratories)试剂盒说明书步骤逆转录成cDNA。采用ABI Prism 7900HT荧光定量PCR仪检测(Applied Biosystems)，以ABL1作为内参，每个实验重复做3次。SPAG5和ABL1基因的引物及TaqMan探针采用美国ABI公司商品(Hs00197708_m1和Hs00245445_m1)。RT-PCR体系为：TaqMan®Gene Expression Master Mix(2×) 10 μL，引物及TaqMan探针1 μL，cDNA 2 μL(相当于100 mg RNA)，加双蒸水补足反应总体积为20 μL。反应条件为：50 ℃ 2 min预变性，95 ℃ 10 min热启动，95 ℃ 15 s变性，60 ℃ 60 s退火延伸，40个循环，60 ℃延伸时采集荧光信号。将SPAG5基因已知阳性模板从10～1×103倍比稀释，作标准曲线，曲线斜率为-0.301 9，相关系数为0.9966。PCR扩增效率106%，提示该PCR反应体系及引物均正常。ABL1内参基因的实时荧光定量PCR体系及条件同SPAG5基因，反应40个循环。采用2-ΔCt进行相对定量分析。

1.3 SPAG5蛋白检测 采用免疫组化法。实验步骤严格按照链霉菌亲和素—过氧化物酶法(SP)两步法进行。SPAG5抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。常规脱蜡、水化,3% H2O2室温孵育15 min,枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复,加入多克隆兔抗人SPAG5抗体(稀释比1∶1 000)置于室温下2 h，使用Envisionfi过氧化物酶试剂盒(Dako)检测抗原抗体反应。然后将组织在室温下用0.05% 3,3-二氨基联苯胺(Dako)中孵育30 s，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。染色后请两位中级职称以上病理医生采用半定量H-score评分法对组织标本进行评分，每个标本随机取5个高倍视野(200倍)，以细胞质和细胞膜中出现明显的黄色或棕黄色颗粒视为阳性着色，以染色强度和该强度下细胞的百分比乘积定为标本染色评分[15]。染色强度从阴性至强阳性分别计为1、2、3分；阳性细胞率0计0分，≤10%计1分，>10%～50%计2分，>50%～80%计3分，>80%计4分；总分为0～12，将0～6定为低表达、8～12为高表达。

1.4 随访 患者术后随访采用电话或门诊复查形式，末次随访时间为2019年05月01日。总生存期(OS)为从病理确诊日期到死亡日期或末次随访时间；无疾病生存期(DFS)为从病理确诊日期到疾病复发或死亡时间。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0软件包和Graphpad Prism 8.0.1进行统计学分析及绘图。首先对检测数据进行正态性检验，偏态分布计量资料采用中位数(四分数)[M(P25,P75)]表示。根据Cutoff Finder网站获取SPAG5 mRNA评估预后的截断值[16]。采用Wilcoxon秩和检验比较胃癌组织和癌旁组织SPAG5表达的差异；采用Mann-WhitneyU检验、χ2检验或Fisher精确概率检验比较SPAG5表达与患者临床病理特征的差异；采用Kaplan-Meier方法建立生存曲线，Log-Rank检验方法比较组间差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SPAG5 mRNA在胃癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系 SPAG5 mRNA在所有胃癌组织中均表达，中位相对表达量为0.300(0.145,0.683)。从Cutoff Finder网站获SPAG5 mRNA的最佳截断值为0.184，并根据截断值分为高表达者30例和低表达者11例。SPAG5 mRNA表达与胃癌患者临床病理参数的关系见表1。

表1 41例胃癌组织中SPAG5 mRNA表达与患者临床病理特征的关系

2.2 SPAG5蛋白在胃癌组织中的表达及与临床病理特征的相关性 41例胃癌患者中，SPAG5蛋白高表达率75.6%(31/41)，低表达率24.4%(10/41)；胃癌组织中SPAG5蛋白表达与患者临床病理特征的关系见表2。在胃癌组织芯片研究中，有4例癌组织实验过程中脱落，剩余86例有效样本进行研究。发现胃癌组织SPAG5蛋白表达高于癌旁组织(胃癌组织和癌旁组织的H-score评分中位值分别为8和4)，P<0.01；SPAG5蛋白高表达率69.8%(60/86)，低表达率30.2%(26/86)；SPAG5蛋白表达与患者临床病理特征的关系见表3。

表2 41例胃癌组织中SPAG5蛋白表达与患者临床病理特征的关系[例(%)]

注：本表格中理论频数均小于5，采用Fisher确切概率检验。

2.3 SPAG5表达与胃癌患者预后的关系 41例胃癌患者均获取随访，中位DFS和OS分别为28(11.5～35.0)、33(18.5～36.0)个月。芯片组织中胃癌患者随访时间为88个月，中位OS为24.0(8.0～84.3)个月。Kaplan-Meier生存分析显示，在41例胃癌组织中，SPAG5 mRNA高表达者无病生存率和总生存率分别为46.67%、53.33%，低表达者分别为54.55%、81.82%，两者比较差异均无统计学意义；SPAG5蛋白高表达者无病生存率和总生存率分别为48.39%、58.06%，低表达者分别为50.00%、70.00%，两者比较差异均无统计学意义。在胃癌芯片组织中，SPAG5蛋白高表达者总生存率(31.67%)与低表达者(42.31%)比较差异无统计学意义。

3 讨论

胃癌已成为癌症死亡的最常见病因之一，根据国际癌症研究机构发布的2018年全球最新癌症统计报告显示，因癌症死亡的病例中，胃癌占8.2%，居第2位[17]。尽管胃癌诊疗技术不断完善，但是胃癌5年生存率仍很低[18]，因此迫切需要胃癌早期诊断和评估患者预后的生物标志物。大量研究表明，胃癌的发生发展与过表达一些致癌基因密切相关。近来研究发现，在某些肿瘤中可检测位于染色体Ch17q11.2上SPAG5基因的过表达且其参与体内不同的分子生物学过程包括细胞增殖和凋亡[19,20]。2016年Abdel-Fatah等报告在10%～19%乳腺癌中存在Ch17q11.2基因位点扩增，且SPAG5基因拷贝畸变数与患者不利的临床预后及不良的临床病理特征相关，包括TP53突变、PAM50-LumB表型和PAM50-HER2表型等[19]。更进一步研究显示，SPAG5高表达与患者预后不良相关。SPAG5高表达患者对含蒽环类药物的新辅助化疗更敏感，患者生存期更长，其原因可能是SPAG5扩增导致染色体不稳定和纺锤体着丝点松弛，提高蒽环类药物干扰有丝分裂，从而提高抗肿瘤作用，故SPAG5是乳腺癌患者蒽环类新辅助化疗方案的独立预测因子之一[19,21]。下调宫颈癌中SPAG5的表达发现，有丝分裂G2/M期受阻，细胞增殖受抑，从而阻止癌细胞的转移和增殖[12]。Liu等[10]发现SPAG5可通过上调Wnt3来激活AKT/mTOR信号通路，促进膀胱癌细胞增殖，抑制其凋亡。在肝癌研究中，SPAG5通过β-catenin/TCF4信号通路下调SCARA5的表达促进肝癌细胞增殖[11]。综上可见，SPAG5目前多被认为发挥促进肿瘤细胞生长的作用，可视为新的生物标志物。

表3 胃癌组织芯片中SPAG5蛋白表达与患者临床病理特征的关系[例(%)]

为探索SPAG5与胃癌的关系，对41例胃癌患者研究发现，SPAG5 mRNA表达与胃癌患者临床病理因素无明显相关性，SPAG5蛋白表达仅与患者的性别相关，女性患者高表达比例高于男性。生存分析发现，SPAG5表达与患者DFS及OS均无明显相关性。考虑前期研究样本量偏少，且缺少癌旁组织进行对照，为进一步完善实验，获得更可靠的实验结果，我们检测了商品化的胃癌组织芯片中SPAG5的表达，结果发现癌组织SPAG5表达高于癌旁组织，但SPAG5蛋白表达高低与患者临床病理因素及OS均无显著相关性。虽然芯片组织中SPAG5蛋白表达高低与性别无明显相关性，但女性患者高表达比例高于男性，因此，SPAG5与性别的关系需进一步研究。采用UALCAN网站(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)分析TCGA数据库中胃癌患者SPAG5 mRNA表达与OS的关系，同样发现SPAG5基因表达与OS无相关(P=0.79)，结果与本课题一致，提示SPAG5在胃癌中无预后判断价值。但是，Liu等[22]最近报道SPAG5高表达与胃癌患者不利预后显著相关，且高表达与肿瘤直径≥5 cm和晚分期明显相关，女性患者高表达比例高于男性(66% vs. 58%)，但差异不显著，进一步机制研究发现，SPAG5通过上调Survivin蛋白，激活wnt/β-catenin信号通路，促进胃癌细胞增殖。虽然本研究的结果与TCGA数据库一致，但是与Liu等实验结果存在差异，这可能与特定的人群及样本量相关。此外，实验材料和过程以及结果判读与本研究也不尽相同。

本项研究仍然存在一些不足之处，该研究为回顾性研究，样本量偏少，关于患者信息及疾病特征的收集纳入会存在不可控的偏倚，且患者术后治疗方式不能详细获得。此外，该研究纳入的临床数据有限，因此SPAG5与胃癌患者其他的临床病理特征的相关性无法分析。由于SPAG5与患者预后无显著相关性，所以未进一步拟合COX回归分析。因此，需要从不同医院收集更多的胃癌标本来证实SPAG5与胃癌的关系。SPAG5在胃癌发生发展中的分子生物学机制需要进一步阐明。

综上所述，胃癌组织中SPAG5表达高于癌旁组织，SPAG5表达高低可能与患者性别有关，SPAG5不具有评估胃癌患者预后作用，需进一步扩大样本来验证结果的可靠性。