沙蟾毒精对骨肉瘤U2OS细胞增殖、凋亡、侵袭的影响及机制

方硕，余铃，郭卫春

武汉大学人民医院，武汉 430060

骨肉瘤是最常见的原发性骨恶性肿瘤，在世界范围内的发病率为百万分之一至三。该病主要发生于儿童和青少年，50岁以上人群有第二个发病高峰[1]。骨肉瘤的主要治疗方法是手术切除。然而，仅手术治疗骨肉瘤患者的生存率为15%～17%[2]。20世纪70年代早期，高剂量甲氨蝶呤和长春新碱及叶酸被引入辅助化疗，以辅助手术切除，使得非转移性骨肉瘤患者的生存率提高了两倍。目前的治疗方法包括手术切除和联合化疗(阿霉素和顺铂加或不加甲氨蝶呤)，可治愈70%的患者[3]。然而，在过去的30年中，转移性或复发性骨肉瘤患者的生存率几乎无变化，总体5年生存率约为20%。中药天然产物中的抗癌药物已引起国际广泛关注。蟾酥是一种从蟾蜍的皮肤和腮腺中提取的中药，沙蟾毒精是蟾酥的主要活性成分之一[4]。沙蟾毒精最初被认为是一种强效的Na+-K+泵抑制剂，具有阻断心肌细胞Na+-K+泵的能力[5]。近年来研究发现，沙蟾毒精在某些恶性肿瘤中具有潜在的抗肿瘤活性。Deng等[6]发现，沙蟾毒精可通过激活YAP的促凋亡活性来抑制MCF-7乳腺癌增殖；Chen等[7]研究表明，沙蟾毒精能抑制β-catenin表达，从而减少前列腺癌转移。然而，其抗骨肉瘤作用及其潜在机制少见报道。2018年8月～2019年9月，本研究通过观察不同浓度沙蟾毒精对人骨肉瘤U2OS细胞增殖、凋亡、侵袭和转移的影响，初步探讨沙蟾毒精抗骨肉瘤的相关机制，为沙蟾毒精进一步临床应用提供实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 沙蟾毒精购自美国Sigma-Aldrich公司；cell counting kit-8(CCK-8)购自北京索莱宝公司；Hoechst 33258购自美国Sigma-Aldrich公司；Transwell小室购自美国Corning公司；DMEM培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司；青链霉素和PBS购自武汉谷歌公司；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒购自美国Thermo公司。

1.2 细胞培养 人骨肉瘤U2OS细胞系购于中国典型培养物保藏中心；细胞采用含10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM培养基培养；细胞培养于37 ℃、5% CO2培养箱中，每天换液，间日传代，取对数生长期的细胞进行实验。

1.3 细胞抑制率测算及沙蟾毒精浓度筛选 采用CCK-8细胞毒性实验。U2OS细胞采用胰酶消化，制成细胞悬液，并稀释至3.5×104个/mL。在96孔细胞板中标记，并在每孔中加入200 μL细胞稀释悬液，培养24 h待细胞贴壁后，按照标记分别加入不同总浓度的沙蟾毒精(0、25、50、75、100、125、150、175、200 nmol/L)。处理24 h后，吸出培养基，每孔加入含10% CCK-8的完全培养基100 μL培养2 h，酶标仪检测450 nm处OD值，并计算细胞抑制率。发现0、25、50、75、100、125、150、175、200 nmol/L沙蟾毒精作用U20S细胞24 h的增殖抑制率分别为(0.38±1.63)%、(15.67±4.61)%、(25.73±3.72)%、(37.46±3.89)%、(45.31±2.05)%、(52.79±2.47)%、(57.56±3.66)%、(63.18±5.25)%、(66.16±4.28)%，各浓度两两相比P均<0.01。沙蟾毒精处理U2OS细胞24 h的半抑制浓度(IC50)为107.8 nmol/L。因此，本研究以50、100、150 nmol/L的沙蟾毒精处理U2OS细胞24 h进行后续的机制研究。

1.4 细胞凋亡情况观察 采用Hoechst 33258检测。将U2OS细胞接种于6孔板中，采用0、50、100、150 nmol/L的沙蟾毒精处理U2OS细胞24 h，然后PBS漂洗2次，采用4%多聚甲醇固定20 min，PBS冲洗，Hoechst 33258避光染色10 min，采用荧光显微镜观察结果。

1.5 细胞侵袭能力观察 采用Transwell法检测沙蟾毒精对U2OS细胞侵袭能力的影响。Transwell小室预先采用基质胶包被，采用0、50、100、150 nmol/L的沙蟾毒精处理U2OS细胞24 h后胰酶消化并收集细胞，将不含胎牛血清的1×105个细胞置于Transwell小室上层，小室下层中加入含10%胎牛血清的培养基800 μL，然后将Transwell系统放入37 ℃细胞培养箱中培养48 h。用棉签擦去小室内侧的细胞，将小室外侧的细胞采用结晶紫染色20 min，在显微镜下观察实验结果，并计算细胞穿过小室膜的数量。

1.6 细胞Bax、Bcl-2、caspase-3、MMP-2、MMP-9 mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR技术。采用0、50、100、150 nmol/L的沙蟾毒精处理U2OS细胞24 h，应用TRIzol法提取细胞总RNA，参照试剂盒说明逆转录合成cDNA并扩增合成目的片段。以β-actin作为内参目的基因，通过观察扩增曲线来测量相关mRNA的CT值。引物序列如下：Bax正向引物为5′-GAAGCCGGTGGTGGAGAA-3′，反向引物为5′-GCTTGGAGTTGGGCTGGTG-3′；Bcl-2正向引物为5′- GAAGCAGGTAATGGAGCAAGGA-3′，反向引物为5′-GAAGCGTAGTTGTTGAGATGCG-3′；caspase-3正向引物为5′-GCGGTTGTAGAAGTTAATAAAGGTA-3′，反向引物为5′-CATGGCACAAAGCGACTGG-3′；MMP-2正向引物为5′-GAGTGCATGAACCAACCAGC-3′，反向引物为5′-AAACTTGCAGGGCTGTCCTT-3′；MMP-9正向引物为5′-TCTATGGTCCTCGCCCTGAA-3′，反向引物为5′-TTGTATCCGGCAAACTGGCT-3′；β-actin正向引物为5′-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3′，反向引物为5′-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3′。以2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

2 结果

2.1 沙蟾毒精对U2OS细胞凋亡的影响 Hoechst 33258染色显示，0 nmol/L沙蟾毒精处理U2OS细胞24 h后，细胞核完整，染色质均匀；50、100、150 nmol/L处理后细胞核裂解，染色质凝聚、固缩，产生凋亡小体。随着处理浓度增加，镜下细胞明显减少，并且出现细胞核固缩，碎裂的细胞数量增加。

2.2 沙蟾毒精对U2OS细胞侵袭能力的影响 0、50、100、150 nmol/L沙蟾毒精处理U2OS细胞透膜数分别为(270.33±13.05)、(206.00±18.08)、(128.67±17.79)、(82.67±15.01)个，两两相比P均<0.05。

2.3 沙蟾毒精对U2OS细胞凋亡、侵袭相关基因表达的影响 见表1。

表1 不同浓度沙蟾毒精处理后U2OS细胞凋亡、侵袭相关基因表达比较

注: 与0 nmol/L比较，#P<0.01。

3 讨论

骨肉瘤是最常见的骨恶性肿瘤之一，主要发生于青少年。随着80年代化疗的引入，骨肉瘤患者的5年生存率近年来有了显著提高。术前、术后化疗已成为骨肉瘤患者的标准治疗方法。然而，骨肉瘤患者使用的药物在近几十年基本保持不变，如甲氨蝶呤和顺铂，其效果仍不理想[8]。因此，寻找新的有效药物来提高骨肉瘤患者的生存率和生活质量至关重要。

蟾酥是我国传统中药，被列入《中国药典》，具有强心、镇痛、抗肿瘤等多种药理活性。沙蟾毒精是从蟾酥中提取的一种甾体类化合物，是蟾酥主要活性成分之一[9]。目前研究发现，沙蟾毒精能够抑制非小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌等不同类型的人类肿瘤细胞的生长、转移，并诱导凋亡。沙蟾毒精通过Noxa相关通路诱导人非小细胞肺癌细胞凋亡[10]；沙蟾毒精可以诱导胰腺癌细胞凋亡和G2/M期阻滞，并增强胰腺癌细胞对化疗的敏感性[11]。但沙蟾毒精对骨肉瘤的影响及机制尚不清楚。

本研究采用不同浓度的沙蟾毒精处理人骨肉瘤细胞系U2OS，并采用CCK-8法检测其增殖情况。结果发现低浓度(25 nmol/L)的沙蟾毒精即可明显抑制U2OS细胞增殖，且随着处理浓度的增加，抑制效果增加。提示沙蟾毒精能够抑制骨肉瘤细胞的增殖。

细胞凋亡在肿瘤的发生和发展中起重要作用，很多药物是通过诱导肿瘤凋亡来抑制肿瘤的进展[12]。细胞的许多形态变化表明细胞凋亡的发生，包括细胞收缩、膜泡化、细胞核碎裂和缩聚以及凋亡小体的形成。为了研究沙蟾毒精是否能够诱导U2OS细胞的凋亡，本研究采用Hoechst 33258染色来检测细胞核形态的改变。结果显示，未经沙蟾毒精处理的细胞细胞核均一，完整；经过沙蟾毒精处理后的U2OS细胞清晰可见亮蓝色荧光，细胞核浓缩、破碎[13]。这进一步证实沙蟾毒精可以诱导骨肉瘤细胞凋亡。

Bax和caspase-3为凋亡相关基因，Bcl-2为抗凋亡相关基因[14]。为探讨沙蟾毒精诱导细胞凋亡的分子机制，本研究采用实时荧光定量PCR技术检测凋亡相关mRNA表达变化。这些基因表达与线粒体介导的凋亡通路有关，Bcl-2能够阻止细胞凋亡，Bax能够通过Bcl-2结合并拮抗其作用，从而促进细胞凋亡[15]。实时荧光定量PCR结果显示，沙蟾毒精能够显著促进U2OS细胞凋亡相关基因Bax和caspase-3 mRNA的表达，并抑制抗凋亡相关基因Bcl-2 mRNA的表达。沙蟾毒精促进Bax表达并抑制Bcl-2表达，增加了线粒体膜的通透性，随后激活caspase-3，并产生剪切，最终诱导细胞凋亡[16]。推测沙蟾毒精可能通过线粒体途径诱导细胞凋亡。

除了细胞增殖外，侵袭和转移被认为是恶性肿瘤的两个重要生物学特征。细胞迁移和侵袭在肿瘤转移中起重要作用[17]。本研究Transwell侵袭实验结果显示，随着沙蟾毒精浓度的增加，U2OS细胞的穿膜数量减少，说明沙蟾毒精能够抑制骨肉瘤细胞的侵袭能力。肿瘤转移需要首先降解细胞外基质并穿过细胞膜，MMPs已被证实参与大多数细胞外基质的降解。MMP-2和MMP-9为侵袭与转移相关基因[18]，被证实参与骨肉瘤的侵袭和转移[19,20]。实时荧光定量PCR结果显示，沙蟾毒精能够显著抑制U2OS细胞MMP-2和MMP-9 mRNA的表达，部分证实沙蟾毒精抑制骨肉瘤细胞侵袭、转移的机制。

综上所述，沙蟾毒精能抑制U2OS细胞增殖；可能通过线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡，其机制与促进Bax、caspase-3表达和抑制Bcl-2表达有关；能够抑制细胞侵袭和转移，其机制与抑制MMP-2和MMP-9表达有关。总之，本研究为骨肉瘤治疗提供了新的方向，为进一步深入研究沙蟾毒精治疗骨肉瘤提供了基础。