miR-613在肝细胞癌中的表达变化及其对癌细胞增殖、凋亡及侵袭、迁移能力的影响

曾保征，王赣，陈超，黄远丽，董超

1麻城市人民医院，湖北麻城 438300；2华中科技大学同济医学院附属荆州医院

肝细胞癌(HCC)是一种常见的肝脏原发恶性肿瘤，具有较高的发病率和致死率，患者的5年生存率低于12%[1]。HCC的发生与酒精性肝硬化、病毒性肝炎等有关，其发生、发展及迁移、侵袭与基因、蛋白、细胞因子等许多因素有关。miRNA是近年来发现的小分子短链非编码RNA，广泛参与细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭等生物学过程。近期国内外研究表明，miR-613在宫颈癌[2]、胃癌[3]、卵巢癌[4]、非小细胞肺癌[5]等多种恶性肿瘤中表达异常，与恶性肿瘤的发生发展密切相关。但目前国内外有关miR-613在HCC中表达变化的研究甚少，并且作用机制尚不明确。因此，本研究观察了HCC组织中miR-613的表达情况，并探讨了miR-613过表达对HCC细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年7月～2018年6月在麻城市人民医院治疗的60例HCC患者，所有患者诊断均经病理学检查证实，手术前均未进行放疗或化疗等治疗。选取手术切除肿瘤组织为HCC组织，同时选取离肿瘤组织边缘5 cm以外的癌旁组织作为对照。60例患者中男44例、女16例，年龄(56.75±12.86)岁。根据国际抗癌联盟(UICC)肝癌TNM分期标准[6]对HCC患者进行临床分期，其中Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期41例。根据Edmondson标准[7]对患者进行病理分级，其中Ⅰ级19例，Ⅱ～Ⅲ级19例，Ⅳ级22例。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。

1.2 细胞来源及培养 人HCC细胞系MHCC97H、SMMC-7721和人正常肝细胞系L02购自中国科学院上海细胞库，采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液进行培养，在温度为37 ℃、5% CO2、饱和湿度的情况下进行细胞传代培养。

1.3 miR-613检测 采用miRNA分离纯化试剂盒(美国Ambion公司)提取肝癌组织、癌旁组织标本及细胞的总miRNA，采用TaqMan miRNA反转录试剂盒(美国Applied Biosystems公司)对总miRNA进行反转录生成cDNA。取cDNA，按照TaqMan miRNA检测试剂盒说明书检测miR-613的表达水平。引物由美国GeneCopoeia公司设计合成。引物序列如下：miR-613引物上游为5′-ACACTCCAGCTGGGATGGAATGTTCCTTC-3′,下游为5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGAAACGG-3′；U6引物上游为5′- CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反应条件为10 min 95 ℃，10 s 95 ℃，20 s 60 ℃，15 s 72 ℃，共40个循环。以U6作为内参照，以2-ΔΔCt法计算miR-613的相对表达量。

1.4 细胞转染 将SMMC-7721细胞接种于6孔板中，细胞分为miR-613 mimics组和mimics-NC组，在细胞处于对数生长期时分别将购自上海吉玛制药公司的miR-613模拟物(miR-613 mimics)或模拟物阴性对照(mimics-NC)转入各组SMMC-7721细胞，6 h换1次培养液，共培养24～48 h，收集细胞进行后续实验。采用实时荧光定量PCR技术检测miR-613的表达，验证转染效率。

1.5 细胞增殖情况观察 采用MTT实验。将miR-613 mimics组、mimics-NC组细胞接种于96孔板，每孔接种细胞数为1×104个，每组设3个复孔，转染成功后24、48、72 h每孔加入10 μL的MTT溶液(美国Sigma公司)培养4 h，再加入100 μL的溶解液，直至紫色结晶溶解，在酶标仪上测定492 nm处的光密度(OD)值。以OD值表示细胞的增殖活性。

1.6 细胞凋亡情况观察 采用流式细胞术。离心收集miR-613 mimics组、mimics-NC组转染成功48 h后的细胞，用培养基重悬细胞使细胞悬液浓度为1×109/L。按Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(南京凯基生物公司)说明书操作，取细胞悬液0.5 mL，加入1.25 μL的Annexin V-FITC在室温下进行15 min的避光反应，离心收集细胞，采用预冷的1×结合缓冲液0.5 mL轻轻重悬，加入10 μL的碘化丙啶避光保存于冰上，采用CytoFLEX流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)检测细胞的凋亡率。

1.7 细胞侵袭及迁移情况观察 采用Transwell小室迁移和侵袭实验。在Transwell小室接种前，将Matrigel(美国BD公司)预铺小室上室。在上室接种200 μL浓度为2×105/mL的无血清培养基细胞，下室加入600 μL的含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，培养24 h后，取出Transwell小室，用4%多聚甲醛溶液对细胞进行固定，结晶紫染色后将上层细胞擦掉并用PBS洗涤。在高倍显微镜下计数穿过小室膜的细胞数并取平均值，即为侵袭穿膜细胞数，实验重复3次，取平均值。迁移实验时，不用Matrigel预铺小室上室，其余步骤同侵袭实验。

2 结果

2.1 miR-613在HCC组织中的表达及其与临床病理参数的关系 miR-613在HCC组织的表达为0.32±0.11，较癌旁组织(0.98±0.04)表达降低(t=43.678，P<0.05)。以miR-613表达的均值为截断点，分为高表达(23例)和低表达(37例)。miR-613表达与HCC患者临床病理参数的关系见表1。

2.2 miR-613在人肝细胞系中的表达 miR-613在人HCC细胞系MHCC97H和SMMC-7721的相对表达量分别为0.52±0.13、0.21±0.09，均较人正常肝细胞系L02(1.05±0.11)表达降低(t=5.391、10.237，P均<0.05)。选择miR-613表达最低的SMMC-7721细胞作为后续研究对象。

2.3 miR-613对SMMC-7721细胞增殖活性的影响 转染后，miR-613 mimics组miR-613相对表达量为5.47±0.34，较mimics-NC组(0.99±0.06)升高(t=22.475，P<0.05)，提示转染效率较高。miR-613对SMMC-7721细胞增殖的影响见表2。

表1 miR-613表达与HCC患者临床病理参数的关系[例(%)]

表2 miR-613对SMMC-7721细胞增殖的影响

注：与mimics-NC组相比，*P<0.05。

2.4 miR-613对SMMC-7721细胞凋亡的影响 miR-613 mimics组细胞凋亡率为(26.48±4.14)%，较mimics-NC组[(5.98±1.75)%]升高(t=7.900，P<0.05)。

2.5 miR-613对SMMC-7721细胞迁移及侵袭的影响 miR-613 mimics组、mimics-NC组迁移细胞数分别为(160±22)、(342±34)个，侵袭细胞数分别为(105±19)、(279±23)个，两组相比P均<0.05。

3 讨论

HCC早期症状较为隐匿，70%～80%的患者发现时已为晚期，诊断后患者的平均生存时间为6个月，没有治疗的患者5年生存率小于3%[8]。随着医疗技术的发展，HCC的病死率有所下降，但HCC的复发率较高，患者预后仍然很差。随着蛋白质组和基因组学研究的发展，近期研究发现miRNA在不同肿瘤中表达模式不同，并且与恶性肿瘤的发生发展密切相关，为恶性肿瘤的靶向治疗提供了新的思路。

miR-613是一种近期发现的存在人体内的miRNA家族成员之一，其定位于人染色体12p13.1，含有20个核苷酸。miR-613在多种肿瘤组织或细胞中呈低表达，具有调控肿瘤细胞增殖和转移的作用。李传芬等[9]研究表明miR-613在胶质瘤组织中呈低表达，且miR-613可抑制胶质瘤细胞的生长、迁移和侵袭。张东兵等[10]的研究表明，上调miR-613可抑制甲状腺乳头状癌的增殖和迁移及侵袭。Yu等[11]研究表明miR-613在膀胱癌组织和细胞中呈低表达，可抑制膀胱癌细胞的增殖和侵袭。上述文献研究表明，miR-613在肿瘤的发生发展中可能起着抑癌基因的作用。本研究发现miR-613在HCC组织的表达明显低于癌旁组织，在人肝癌细胞系中表达低于正常肝细胞系，与上述其他恶性肿瘤中的研究结果一致。本研究进一步统计分析表明,TNM分期越晚，miR-613表达越低；Edmondson分级越高，miR-613表达越低，提示miR-613与HCC的发生进展有关，对HCC的分期和病理分级具有潜在的预测价值。

研究发现，恢复肿瘤细胞内异常表达的miRNA水平可以有效抑制恶性肿瘤的发展，因此可能成为一种有效的分子靶向治疗方式。本研究发现，上调miR-613后SMMC-7721细胞增殖活性明显降低，细胞凋亡率明显升高，侵袭和迁移实验中穿过小室膜的细胞数均明显减少，结果表明过表达miR-613能够抑制HCC细胞增殖、迁移和侵袭，同时促进细胞凋亡。文献研究表明，在肾细胞癌中，miR-613通过靶向CTTN而调控细胞的增殖和迁移[12]。Wang等[13]发现，在非小细胞肺癌中，miR-613通过靶向调节双皮质素激酶样结构域1而致使细胞周期停滞。Wu等[14]发现，在乳腺癌中miR-613通过靶向血管内皮生长因子A而抑制细胞的增殖和侵袭。miR-613在HCC中作用的具体下游靶基因，尚需在进一步的研究中预测并验证。

综上所述，miR-613在HCC中呈低表达，过表达miR-613能够抑制HCC细胞增殖、迁移和侵袭，同时促进细胞凋亡，这为HCC的靶向治疗提供了新的方向。