碳化二亚胺/羟基丁二酰亚胺交联改性胶原蛋白纤维制备及其性能

岳程飞, 丁长坤, 李 璐, 程博闻

(天津工业大学 天津市先进纤维与储能技术重点实验室， 天津 300387)

胶原蛋白是主要的细胞外基质分子[1-2]，其自身可自组装成具有横条纹的原纤维，为细胞生长提供支持，并负责结缔组织的力学弹性[3-4]。在低温环境下提取的胶原，仍可保持胶原特有的3股螺旋结构，制备的材料也具有较好的柔韧性、低免疫原性、生物相容性与可降解性[5]；但天然胶原蛋白本身也存在很多缺陷，如力学性能差，耐水溶性差，不经改性处理很难达到使用要求[6]，因此，通常需要对制备的胶原材料进行改性处理[7]，以提高其实际使用性能。

物理交联和化学交联是胶原蛋白主要的交联改性方法[8]。胶原的物理交联主要是通过紫外线照射、重度脱水以及热处理等方法，在胶原分子间产生交联，从而改善胶原的物理性能[9-11]。物理交联虽然交联度普遍偏低，但在交联过程中一般不会引入外源性物质，也不会产生不利于生物体的物质。胶原的化学交联主要是通过化学交联剂在胶原分子的精氨酸、羟赖氨酸、组氨酸以及赖氨酸等残基之间生成新的化学键，从而达到较高的交联度[7，12]。常见的化学交联剂主要有戊二醛[13]、碳化二亚胺[14]、京尼平[15]等，不同的交联剂在交联反应中会产生不同的物质。

碳化二亚胺是一种化学性质活泼的交联剂，特别是1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)作为交联剂时，会在相邻胶原分子之间形成异构肽键。同时，EDC不会滞留在胶原分子内，而是通过交联过程中的一系列化学反应转化成一种细胞毒性极低的水溶性脲衍生物。这使得整个交联过程既不会引入明显的细胞毒性，又有较好的交联效果[14，16]。目前，最常用的碳化二亚胺交联剂是将EDC和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)按一定比例配合使用，从而达到较高的交联度。本文将牛肌腱胶原蛋白与一定比例的EDC/NHS充分混合后，在一定条件下进行湿法纺丝，得到经过原位交联的胶原蛋白纤维，比较了原位交联与交联浴交联胶原蛋白纤维的性能差异。

1 实验部分

1.1 原料与试剂

牛肌腱胶原蛋白，天津市赛宁生物工程技术有限公司；1-乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；冰乙酸、丙酮、氨水，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 实验仪器

湿法纺丝装置，实验室自制；DW-I型无级调速搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；TGL-16M型高速冷冻离心机，湖南湘仪实验仪器开发有限公司；LLY-06型电子单纤维强力仪，莱州电子仪器有限公司；DSA100 M型单纤维接触角测量仪，德国克吕士公司；S4800型场发射扫描电子显微镜，日本日立公司；D/MAX-2500型X射线衍射仪，日本理学公司；TENSOR 37型傅里叶变换红外光谱仪，德国布鲁克科技有限公司；STA449F3型热重分析仪，德国耐驰公司。

1.3 胶原蛋白纤维的制备

纯胶原蛋白纤维的制备：使用浓度为0.5 mol/L的冰乙酸溶液溶解一定量的牛肌腱胶原，配制成质量分数为1.5%的胶原纺丝液。为防止胶原在溶解过程中发生热变性，整个机械搅拌过程维持在4 ℃左右。待胶原完全溶解后，在4 ℃条件下冷冻离心脱泡得到胶原纺丝液。注射泵挤出速度为0.5 mL/min，将纺丝液在凝固浴(成分为丙酮、氨水和去离子水，体积比为60.0∶1.0∶0.2)中静态凝固3 min后得到凝胶态胶原初生纤维，再将胶原初生纤维在室温条件下加5 g砝码悬挂拉伸，自然风干得到纯胶原蛋白纤维。

原位交联胶原蛋白纤维的制备：使用浓度为0.5 mol/L的冰乙酸溶液溶解质量比为3∶1的EDC和NHS，然后加入牛肌腱胶原，在温度约为4 ℃时使用机械搅拌充分搅拌一定时间得到原位交联胶原纺丝液，然后采用上述纯胶原蛋白纤维制备工艺制备原位交联胶原蛋白纤维。为防止纺丝液凝固，胶原溶解后须及时完成纺丝过程。

交联浴交联纯胶原蛋白纤维的制备：在无水乙醇中加入质量比为3∶1的EDC和NHS，然后加入少量氨水调节pH值为8，得到交联浴。将纯胶原蛋白纤维浸没于交联浴中交联一段时间，然后在移出交联浴的胶原蛋白纤维上悬挂5 g的砝码牵伸，自然风干得到交联浴交联胶原蛋白纤维。交联时间和交联浴的浓度均采用原位交联的最佳交联时间和最佳浓度。

1.4 结构表征与性能表征

1.4.1 力学性能测试

使用电子单纤维强力仪测试纤维的力学性能，夹距为10 mm，拉伸速率为10 mm/min，温度为25 ℃，相对湿度为75%。

1.4.2 纤维形貌观察

使用场发射扫描电子显微镜观察纤维的表面与截面形貌。测试前对纤维进行干燥、喷金处理，加速电压为10 kV。

1.4.3 结晶性能测试

使用X射线衍射仪对真空干燥后的纤维进行结晶结构分析，采用Cu/Kα为辐射源，扫描速度为5(°)/min，扫描范围为5°～40°。

1.4.4 化学结构表征

使用傅里叶变换红外光谱仪表征纤维的化学结构，测试波数范围为4 000～400 cm-1。

1.4.5 热稳定性测试

使用热重分析仪测试纤维的热稳定性。测试时在氮气保护环境下以10 ℃/min的升温速率从25 ℃加热到800 ℃，得到样品的热重(TG)曲线。

1.4.6 接触角和耐水溶性测试

使用单纤维接触角测量仪测试纤维的水接触角。通过自动加液装置在纤维上滴加定量液滴后分别测量0、60 s时的水接触角。在室温条件下，将定量的胶原蛋白纤维浸于蒸馏水中，60 s后将其取出置于滤纸上以除去纤维表面残余的水，再置于天平中称取质量，可得到其吸水率，多次测量，取平均值。

2 结果与讨论

2.1 EDC/NHS交联机制

EDC/NHS的交联机制如图1所示。EDC可促使胶原分子间发生交联反应，其自身不与胶原的活性基团反应，而是通过激活胶原分子结构中天冬氨酸和谷氨酸残基上的羧基进行偶合反应，形成一种不稳定的中间产物O-异酰基脲结构[14]。这种中间产物在氨基的攻击下，可在胶原分子内与相邻胶原分子间形成酰胺键，从而完成分子内和分子间的酰胺交联。NHS作为亲核试剂引发交联反应的进行，增强中间产物O-异酰基脲结构的稳定性。EDC、NHS在交联过程中不会成为胶原分子间的一部分，也不会进入胶原基质中，而是转化为一种具有水溶性的脲衍生物，该衍生物可被清洗掉，不会对细胞产生毒性[16]，因此，EDC/NHS是一种极为绿色环保的交联剂。

图1 EDC/NHS交联机制Fig.1 Crosslinking mechanism of EDC/NHS

2.2 原位交联胶原蛋白纤维性能分析

2.2.1 原位交联工艺参数的优化

本文所制备的胶原蛋白纤维主要应用于可吸收手术缝合线，这对纤维的柔软性、打结性以及持结性都有较高的要求。由胶原制备的缝合线成纤性能好，且经适当交联处理可具有较好的耐水、耐热性和优异的力学性能。在EDC/NHS原位交联胶原蛋白纤维的制备过程中，由于是将交联剂与胶原直接共混，所以一旦交联时间过长(或交联剂过多)，胶原有可能在纺丝前出现凝胶化，将直接导致其难以纺制成丝；因而原位交联时间与交联剂用量对纤维纺制和力学性能的影响尤为显著。

采用1.3节中原位交联胶原蛋白纤维的制备方法，使用机械搅拌分别搅拌8、9、10、11、12、13 h，进行纺丝制备得到不同原位交联时间的胶原蛋白纤维，其力学性能测试结果如图2所示。可以看出：当机械搅拌时间在8～11 h之间时，胶原蛋白纤维的断裂强度呈现出明显的增加趋势，这表明胶原分子内以及分子间的交联反应在持续进行，酰胺键在不断生成，胶原分子间的相互作用在不断加强；当机械搅拌时间为11 h时，胶原蛋白纤维的断裂强度达到最大值，随后纤维的断裂强度随着原位交联时间的增加呈现出明显下降趋势，这是因为过长的交联时间导致交联过度，使胶原分子内部的稳定结构遭到破坏[17]。

图2 不同原位交联时间的胶原蛋白纤维力学性能Fig.2 Mechanical properties of collagen fibers at different crosslinking times

分别将质量分数为0%、5%、10%、15%和20%的EDC/NHS交联剂溶于0.5 mol/L冰乙酸中，采用1.3节中原位交联胶原蛋白纤维的制备方法，机械搅拌11 h，制备不同交联剂质量分数的原位交联胶原蛋白纤维，其力学性能测试结果如图3所示。可以看出，随着交联剂质量分数的增加，胶原蛋白纤维的断裂强度呈现出明显的先增长后下降的变化趋势。其中当交联剂质量分数达到15%时，胶原蛋白纤维的断裂强度最大，说明此时胶原蛋白纤维的交联度达到最高。随后胶原蛋白纤维的断裂强度随着交联剂质量分数的增加开始下降，这是因为过量的交联剂导致胶原分子交联过度，分子内部的稳定结构遭到破坏，进而使胶原蛋白纤维的断裂强度降低。

图3 不同原位交联剂质量分数的胶原蛋白纤维力学性能Fig.3 Mechanical properties of collagen fibers with different crosslinker concentrations

2.2.2 原位交联胶原蛋白纤维的形貌分析

图4、5分别示出不同交联剂质量分数制备的胶原蛋白纤维的表面和横截面扫描电镜照片。从图4可看出，没有进行交联的胶原蛋白纤维表面相对比较粗糙，有明显的褶皱存在。这主要是由于胶原分子柔性比较大，在双扩散成型过程中丙酮脱水导致褶皱出现。随着交联剂质量分数的增加，胶原蛋白纤维表面逐渐平整，皱褶开始减小，且出现明显纤维化取向结构[18]。图5表明，随着交联剂质量分数增加，胶原蛋白纤维内部呈现出典型的带状原纤维结构特征。这是因为初生纤维在固化过程中受后拉伸作用而形成有序的胶原分子自组装聚集结构。与图5(a)相比，经原位交联的胶原蛋白纤维横截面结构更规整，显微结构也由交联前的无序结构变为紧密的有序结构[19]。

图4 不同交联剂质量分数的胶原蛋白纤维表面扫描电镜照片(×900)Fig.4 Surface SEM images of collagen fiber surface with different crosslinker concentrations (×900)

图5 不同交联剂质量分数的胶原蛋白纤维横截面扫描电镜照片(×2 000)Fig.5 Cross section SEM images of collagen fiber profile with different crosslinker concentrations (×2 000)

综上所述，原位交联胶原蛋白纤维的最佳交联时间为11 h，交联剂质量分数为15%，后续实验制备原位交联和交联浴交联纤维均采用这2个参数。

2.3 原位交联与交联浴交联纤维性能分析

2.3.1 纤维结晶性能分析

拉伸过程可使初生纤维非晶区的大分子沿纤维轴向的取向显著提高；同时，聚合物在拉伸过程中的形变能量传递也会导致初生纤维的取向提高，使纤维结晶度增加。初生纤维的超分子结构经过拉伸过程发生显著变化，从而得到结构更为完善、性能更为优良的纤维[12]。不同交联方式胶原蛋白纤维的X射线衍射曲线如图6所示。可以看出，纯胶原蛋白纤维的XRD曲线上主要有2个衍射峰。在2θ为7°左右存在1个尖锐的峰，代表胶原分子链间的距离；在2θ为20°附近有1个宽的馒头峰，为胶原蛋白纤维内部众多结构层次所引起的漫反射[19]。与纯胶原蛋白纤维相比，经过EDC/NHS交联的胶原蛋白纤维在2θ为7°处的衍射峰要尖锐得多，强度也有所增加。这说明交联纤维的分子间距有所减小，纤维内部微纤的排列紧密有序，纤维的结晶度增大[20]。同时，在2θ为20°处衍射峰的变化是胶原蛋白纤维内部复杂的多级结构因交联反应的发生而引起的。原位交联纤维的峰强度均高于其他2种纤维，说明其结晶更加完善。对于交联浴交联来说，EDC/NHS的交联反应主要发生在纤维的皮层，纤维内部的反应并不充分；而在相同交联条件下的原位交联可使胶原的交联反应充分进行，进而使湿法纺丝制备的胶原分子排列更规整、紧密，有序程度更高。

图6 不同交联方式的胶原蛋白纤维XRD曲线Fig.6 XRD curves of collagen fibers with different crosslinking modes

2.3.2 纤维化学结构分析

图7示出不同交联方式的胶原蛋白纤维红外谱图。可以看出，纯胶原蛋白纤维的红外光谱主要出现了典型的酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和酰胺A带与B带吸收峰[21]。由EDC/NHS交联胶原蛋白纤维的制备机制可知，胶原分子间的酰胺化将导致相对应的伯氨基数减小，酰胺键增加[14]。胶原蛋白纤维交联前后的红外光谱图中主要表现为酰胺II带(1 547 cm-1)与酰胺I带(1 632 cm-1)吸收峰强度比值的减小，即1 547 cm-1处与1 632 cm-1处的吸收峰面积比值降低，上述这些吸收峰强度的变化表明交联反应的发生[14]。原位交联胶原蛋白纤维的酰胺II带与酰胺I带吸收峰强度比值明显低于交联浴交联的胶原蛋白纤维，表明原位交联更利于促进交联反应的进行。

图7 不同交联方式的胶原蛋白纤维红外谱图Fig.7 Infrared spectra of collagen fibers with different crosslinking modes

2.3.3 纤维热稳定性分析

图8示出不同交联方式的胶原蛋白纤维TG曲线。可以看出，胶原蛋白纤维的热质量损失过程均包括2个阶段。第1阶段是胶原蛋白纤维中自由水和结合水在受热挥发后导致的质量损失，温度范围为60～200 ℃。原位交联胶原蛋白纤维第2阶段的质量损失率和质量损失速率都小于其他纤维，这说明原位交联紧密的取向结构结合的水分少。第2阶段是胶原分子在受热后发生断裂引起的质量损失，初始温度在200 ℃左右，且随着温度的升高，断裂形成的短链进一步降解造成质量损失[13]。经EDC/NHS交联的胶原蛋白纤维的热分解温度高于纯胶原蛋白纤维，这主要是因为交联使胶原蛋白纤维在分子内及分子间形成稳定的交联网络，相互作用进一步增强，自组装结构完善，3股螺旋结构相对更加稳定[14]。在相同交联时间、交联剂质量分数条件下，原位交联后胶原蛋白纤维的热分解温度明显高于交联浴交联胶原蛋白纤维。这表明在同等条件下，原位交联可使胶原蛋白纤维获得更高的交联度。

图8 不同交联方式的胶原蛋白纤维TG曲线Fig.8 TG curves of collagen fiber with different crosslinking methods

2.3.4 纤维耐水溶性分析

由于胶原蛋白属于水溶性蛋白质，未经改性处理的纯胶原蛋白纤维遇水即溶，在湿态时几乎没有任何强度。EDC/NHS作为交联剂可封闭胶原分子表面的亲水官能团，从而降低胶原蛋白纤维的吸水率。表1示出不同交联方式的胶原单纤维接触角和吸水率。一般认为胶原蛋白纤维吸水率高于200%时即为湿态没有强度[22]。由表1可知，经EDC/NHS交联后，胶原蛋白纤维在0、60 s时的单纤维接触角均高于纯胶原蛋白纤维。随着水滴与胶原蛋白纤维的接触时间增加，单纤维接触角也在逐渐减小。同时，胶原蛋白纤维的吸水率变化与单纤维接触角变化具有一致性，且经原位交联的胶原蛋白纤维吸水率降低幅度明显高于交联浴交联。胶原蛋白纤维吸水率的降低与交联度密切相关，交联度越大，吸水率越低。这表明原位交联胶原蛋白纤维的交联度要高于交联浴交联。

表1 不同交联方式的胶原蛋白单纤维接触角和吸水率Tab.1 Contact angle and water absorption of collagen fibers with different crosslinking methods

2.3.5 纤维力学性能分析

表2示出不同交联方式的胶原蛋白纤维力学性能。可以看出，经交联改性的胶原蛋白纤维断裂强度均有增强，且原位交联纤维的断裂强度和断裂伸长率提升最为明显。原位交联胶原蛋白纤维的断裂强度可达(1.44±0.03)cN/dtex，较纯胶原蛋白纤维提高了35.8%，较交联浴交联胶原蛋白纤维提高了19.0%。纤维在交联浴中的交联反应从纤维皮层开始，纤维表面会逐渐形成一层致密的疏水层，从而使交联反应难以进行到纤维内部，影响纤维的交联效果；而原位交联可使交联剂与胶原充分反应，达到较好的交联效果。

表2 不同交联方式的胶原蛋白纤维力学性能Tab.2 Mechanical properties of collagen fibers with different cross-linking methods

3 结 论

1)EDC/NHS原位交联胶原蛋白纤维的最佳时间为11 h，最佳交联剂质量分数为15%，在该条件下制备的胶原蛋白纤维的断裂强度可达1.44 cN/dtex左右，较纯胶原蛋白纤维提高了35.8%。

2)相比交联浴交联，EDC/NHS原位交联胶原蛋白纤维性能提升更为显著，且工艺更为简单、省时。在相同交联时间和交联剂质量分数条件下，原位交联胶原蛋白纤维的断裂强度较交联浴交联提高19.0%。

3)原位交联胶原蛋白纤维的内部微纤结构相对于交联浴交联更加致密，胶原分子间通过酰胺键结合更加紧密；而交联浴交联主要发生在纤维的表面，内部微纤结构难以得到改善。EDC/NHS原位交联胶原蛋白纤维作为一种简便的交联方式，可以显著改善牛肌腱胶原蛋白纤维的结晶性、热稳定性和耐水溶性，有望为开发胶原基高端生物医用纤维材料提供一种新的增强方式。