白藜芦醇对大鼠冻存卵巢组织自体异位移植功能影响的研究

付敏 李明华 耿岚

【摘要】 目的：探究白藜蘆醇对大鼠冻存卵巢组织自体异位移植功能的影响。方法：选取24只成熟雌性Wister大鼠，并分为空白对照组、移植组、低剂量白藜芦醇组和高剂量白藜芦醇组，每组各6只。移植组、低剂量白藜芦醇组和高剂量白藜芦醇组采用手术摘取卵巢，使用玻璃化冷冻保存2周。低剂量白藜芦醇组和高剂量白藜芦醇组卵巢组织在白藜芦醇溶液中平衡，且在大鼠冻存卵巢组织自体异位移植前、后分别腹腔注射5、10 μmol/L白藜芦醇处理，移植组注射等量生理盐水。使用HE染色后光镜下观察卵泡情况，并记录各组大鼠异常卵泡数目百分比。记录各组大鼠月经恢复情况，检测各组大鼠血清内氧化应激相关物质超氧化物歧化酶（SOD）、活性氧基团（ROS）含量水平。分别于第4、8周检测各组大鼠血清激素E2及P的分泌情况。结果：相比空白对照组，移植组异常卵泡数目百分比、ROS含量水平均显著升高，SOD含量及第4、8周大鼠E2及P含量均显著降低（P<0.05）;相比移植组，低剂量白藜芦醇组和高剂量白藜芦醇组异常卵泡数目百分比、月经恢复时间、ROS含量水平均显著降低，第4、8周E2、P和SOD含量均显著升高（P<0.05）。结论：白藜芦醇对大鼠冻存卵巢组织自体异位移植功能恢复有促进作用，同时可以降低大鼠氧化应激反应保护大鼠卵巢。

【关键词】 卵巢组织 自体异位移植 白藜芦醇 冷冻保存

Effects of Resveratrol on Autologous Ectopic Transplantation of Frozen Ovarian Tissues in Rats/FU Min， LI Minghua， GENG Lan. //Medical Innovation of China， 2020， 17（01）： 00-005

[Abstract] Objective： To investigate the effects of Resveratrol on autologous ectopic transplantation of frozen ovarian tissues in rats. Method： A total of 24 mature female Wister rats were enrolled and divided into blank control group， transplantation group， low-dose Resveratrol group and high-dose Resveratrol group， 6 cases in each group. The transplantation group， low-dose Resveratrol group and high-dose Resveratrol group were given surgery to obtain ovaries. And they were preserved by vitrification for 2 weeks. Before and after autologous ectopic transplantation of frozen ovarian tissues in rats， low-dose Resveratrol group and high-dose Resveratrol group were intraperitoneally injected with 5 and 10 μmol/L Resveratrol. The transplantation group was injected with same amount of Normal Saline. After HE staining， follicles were observed under light microscope. The percentage of abnormal follicles number in each group was recorded， the recovery of menstruation in each group was recorded， the levels of oxidative stress related substances such as superoxide dismutase （SOD） and reactive oxygen species （ROS） in serum of each group were detected. On the 4th week and 8th week， secretion of serum hormones E2 and P in each group were detected. Result： Compared with the blank control group， percentage of abnormal follicles number and ROS level were significantly increased in transplantation group. The levels of SOD E2 and P on 4th week and 8th week were significantly decreased （P<0.05）. Compared with the transplantation group， percentage of abnormal follicles number， recovery time of menstruation and ROS level were significantly decreased in low-dose Resveratrol group and high-dose Resveratrol group， the levels of E2 and P on 4th week and 8th week and SOD level were significantly increased （P<0.05）. Conclusion： Resveratrol can promote function recovery of autologous ectopic transplantation of frozen ovarian tissue in rats， and reduce oxidative stress response to protect rat ovaries.

[Key words] Ovarian tissue Autologous ectopic transplantation Resveratrol Cryopreservation

First-authors address： Peking University Shenzhen Hospital， Shenzhen 518036， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.01.001

卵巢冷冻移植是女性生育力保存的重要部分，是解决面临放化疗的年轻女性患者生育问题的重要手段[1-2]。随着近20年肿瘤治疗学的发展，近5年女性肿瘤死亡率以每年1.6%的速度下降，越来越多存活至生育期的女性有生育需求，卵巢冷冻移植成为当下关注的研究项目之一。目前女性生育力保存包括胚胎、卵母细胞及卵巢的冷冻保存[3]。胚胎冷冻保存已经成熟，卵母细胞的冷冻保存也已经走出了试验阶段[4-5]。但是，对于不能推迟肿瘤治疗时间和不允许接受促排卵治疗的女性没有办法采用冷冻胚胎与成熟卵母细胞的方式进行生育力保存，同时我国政策不允许未婚女性冷凍胚胎及卵母细胞，使得卵巢冷冻移植亟待解决。本文研究白藜芦醇对大鼠冻存卵巢组织自体异位移植功能的影响，以期了解白藜芦醇对大鼠冻存卵巢组织自体异位移植功能的影响，为卵巢冷冻提供一定的理论依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验研究时间为2017年12月

-2018年8月，成熟雌性Wiste大鼠，8～10周龄，体重200～220 g，购自广昆明医科大学动物中心，动物实验室资质情况：许可证号：SYXK（粤）2010-0106，所有大鼠分6个笼子饲养，每个笼子4只。所有大鼠均在本院动物中心实验室饲养，饲养温度20～25 ℃，相对湿度50%～65%，该实验经过动物伦理委员会批准同意。

1.2 方法

1.2.1 分组与干预 每只大鼠2个卵巢，每个卵巢切成2片，对卵巢组织薄片进行处理和观察，本实验共纳入大鼠24只，随机分为4组，每组大鼠6只，每组24片卵巢组织薄片。不同浓度白藜芦醇（Sigma公司，批号：R5010）采用生理盐水配制而成。对照组不经过任何处理的卵巢组织，进行新鲜移植;低剂量白藜芦醇组分别于卵巢组织切除冻存前1 h、移植后腹腔注射5 μmol/L白藜芦醇5 mL，卵巢组织解冻后在0.5 μmol/L白藜芦醇中孵育10 min;高剂量白藜芦醇组分别于卵巢组织切除冻存前1 h、移植后静脉注射10 μmol/L白藜芦醇5 mL，卵巢组织解冻后在1 μmol/L白藜芦醇中孵育10 min;移植组常规对卵巢组织进行冷冻、复苏和移植，不经过白藜芦醇处理。

1.2.2 卵巢组织获取 将24只大鼠适应性喂养1周，以手术方式获取卵巢，手术前30 min用肌注盐酸氯胺酮（生产厂家：浙江九旭药业，批准文号：国药准字H20023609，规格：5 mg/kg）进行全身麻醉，手术切开采用脐下正中切口行腹部手术获取卵巢组织。

1.2.3 卵巢组织的冷冻保存与复苏 基础工作液：PBS+10%人血清白蛋白（HAS，SAGE，美国）;冷冻平衡液：PBS+10% HSA+7.5%（v/v）二甲亚砜（DMSO，Sigma，美国）+7.5%（v/v）乙二醇（EG，Fluka，美国）;冷冻液：PBS+10% HSA+15%（v/v） DMSO+20%（v/v） EG+0.5M蔗糖（Sucrose，Sigma，

美国）。卵巢冷冻前用注射器针头刺破肉眼可见的大卵泡，将卵巢组织切成4 mm×2 mm×1 mm的薄片。玻璃化冷冻：将卵巢组织薄片放在冷冻平衡液平衡25 min，放入冷冻液平衡15 min，将冷冻片平铺在载体上，植入外套管中并旋紧，置入液氮罐。解冻液的组成：（1）PBS+10%HSA+1M Sucrose;（2）PBS+10%HSA+0.5M Sucrose，（3）PBS+

10%HSA+0.25M Sucrose;（4）PBS+10%HAS。解冻前将（1）复温至37 ℃，其余步骤在室温进行。复苏：将样本自液氮取出后置于（1）中1 min，然后置于（2）～（4）中各3 min。低剂量白藜芦醇组和高剂量白藜芦醇组的卵巢组织在复苏后分别于100、

200 μmol/L基础工作液中平衡10 min后待用。

1.2.4 卵巢组织移植 实验大鼠麻醉后仰卧位固定，行腹部正中切口，将已复苏的卵巢组织移植于腹膜，逐层缝合。

1.2.5 氧化应激相关物质含量检测 从大鼠颈总动脉插管接取0.1 mL血液，严格按照试剂盒说明书检测SOD、ROS的含量。

1.2.6 组织切片制备、染色与观察 8周后处死大鼠，取大鼠卵巢使用10%福尔马林固定大鼠，使用二甲苯、酒精逐级脱水和石蜡包埋后进行连续5 μm切片，常规HE染色。每隔8张取一张切片在光学显微镜下单盲法观察原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡及窦卵泡的形态，对每个卵巢组织片中形态正常和形态异常的各级卵泡分别计数，计算出每个卵巢组织片中形态正常的各级卵泡的百分率和形态异常的各级卵泡的百分率。为了避免卵泡的重复计数，各级卵泡的计数以卵母细胞核作为标记。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，作图软件采用Graph Pda Prism 5，计量资料用（x±s）表示，分析使用单因素方差分析，组内比较采用配对t检验，计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验，所有检验均为双侧检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组HE染色情况与大鼠异常卵泡百分比比

较 由图1可以看出，空白对照组大鼠卵巢卵泡形态正常，排列较为均匀;移植组大鼠卵泡形态出现核变形、颗粒细胞与基底膜剥离，卵泡内有空泡形成;低剂量白藜芦醇组仍有少数细胞凸向卵泡腔，间质结构疏松，失去致密性，高剂量白藜芦醇组卵巢形态结构基本完整，卵泡排列较为整齐。空白对照组异常卵泡数目百分比为（5.36±0.32）%，移植组为（28.32±2.84）%，低剂量白藜芦醇组为（19.18±2.65）%，高剂量白藜芦醇组为（11.87±2.01）%。相比空白对照组大鼠，移植组大鼠异常卵泡数目百分比显著升高（t=13.863，P=0.000）。相比移植组，低剂量白藜芦醇组大鼠异常卵泡数目百分比显著降低（t=3.759，P=0.001）;相比移植组，高剂量白藜芦醇组大鼠异常卵泡数目百分比显著降低（t=8.153，P=0.000）。

2.2 各组大鼠月经恢复时间 移植组大鼠月经恢复时间为（20.51±2.50）d，显著长于低剂量白藜芦醇组的（15.50±2.51）d（P<0.05）;相比低剂量白藜芦醇组，高剂量白藜芦醇组的（11.51±1.50）d显著降低（P<0.05）。

2.3 各组大鼠雌激素分泌情况 相比空白对照组大鼠，移植组大鼠术后4周及术后8周E2及P含量水平显著降低（P<0.05）;相比移植组，低剂量白藜芦醇组和高剂量白藜芦醇组大鼠术后4周及术后8周E2及P含量水平显著升高（P<0.05）。见表1。

2.4 各组大鼠卵巢组织氧化应激反应情况 相比空白对照组大鼠，移植组大鼠ROS含量水平显著升高（P<0.05），SOD含量水平显著降低（P<0.05）;相比移植组，低剂量白藜芦醇组和高剂量白藜芦醇组大鼠ROS含量水平显著降低（P<0.05），SOD含量水平显著升高（P<0.05）。见表2。

3 讨论

白藜芦醇化学名称为（E）-3，5，4-三羟基二苯乙烯，属于于非黄酮类的多酚化合物，其分子式为C14H12O3，相对分子质量为228.25[6]。白藜芦醇最初在葡萄中被发现，随着技术的发展现在可以从葡萄、花生等提取到白藜芦醇，其中新鲜的葡萄皮中含量最高，达50～100 mg/g，但白藜芦醇提取方法较复杂，主要以人工合成为主[7-8]。陈梦微等[9]研究表明，白藜芦醇具有清除自由基的能力，是一种较好的抗氧化剂。同时何淼等[10]研究表明：白藜芦醇对缺血再灌注损伤也有一定的缓解作用，可以应用于器官移植时移植器官缺血的保护。

本研究发现，实验大鼠均恢复月经周期，说明将大鼠卵巢组织移植于腿根部肌肉内较为成功，这可能是因为大鼠大腿根部具有丰富的血管，血液供应良好，组织疏松，且可以避免移植卵巢受到挤压。研究中发现使用白藜芦醇处理后的大鼠月经恢复时间短于移植组，这可能是因为白藜芦醇缓解了大鼠卵巢在移植过程中受到的暂时性缺血损伤，有效地保护了大鼠的卵巢，使得其移植后功能恢复较快。E2和P是卵巢分泌的两种重要激素，它们与垂体分泌的促性腺激素共同维持雌性个体的月经周期，同时可以通过检测血清E2和P的含量水平反应大鼠卵巢功能情况[11]。本实验发现，相比移植组，低剂量白藜芦醇组和高剂量白藜芦醇组大鼠术后第4、8周血清E2、P含量均显著升高（P<0.05）。说明大鼠卵巢分泌的E2和P显著增加，这可能是因为使用白藜芦醇处理后，白藜芦醇降低了大鼠体内的炎症反应和氧化应激反应，使得大鼠卵巢移植后较为成功，且卵巢功能得到了显著的恢复。王晓光等[12]研究表明：白藜芦醇可以降低了炎症反应和氧化应激反应，使得卵巢移植后，血清E2及P含量均升高，说明卵巢功能得到了恢复，与本研究得出的结论相一致。

随着生活、医疗的需要，活性氧族的研究越来越成熟，实验证实了ROS的大量堆积是导致氧化应激损伤的重要机制之一[13-14]。高婷等[15]研究表明：在健康的细胞内氧自由基的产生和清除是平衡的，但是在氧化应激情况下，会产生大量的ROS并破坏线粒体膜和细胞膜的完整性，使上皮细胞膜的通透性增加，导致细胞内酶SOD、GPX等酶的大量释放。因此，ROS损伤被认为是引起细胞氧化损伤的主要机制。抗氧化体系主要包括酶系和非酶系两大类，酶体系中，最主要的是SOD，其含量多少可以直接反应氧化应激的程度[16-18]。本研究在中发现相比移植组，低剂量白藜芦醇组和高剂量白藜芦醇组大鼠ROS含量水平显著降低，SOD含量水平显著升（P<0.05）。说明使用白藜芦醇后降低了大鼠体内的活性氧族物质，保护了线粒体膜和细胞膜的完整性，使得细胞内酶SOD不被释放到血清中，降低了氧化损伤。庄少虹等[19]研究表明：白藜芦醇可以有效降低体内氧化反应保护细胞膜和线粒体膜的完整性，与本研究得出的结论相一致。

综上所述，白藜芦醇对大鼠冻存卵巢组织自体异位移植功能恢复有促进作用，同时可以保护大鼠卵巢，其作用机制可能与降低大鼠体内氧化应激反应有关。白藜芦醇降低了大鼠体内的氧自由基含量，减缓了氧化反应对大鼠卵巢的损伤，同时促进大鼠卵巢在移植后的恢复。但大鼠卵巢冷冻和人类卵巢冷冻存在一定的区别，在后续的实验中将进行临床卵巢冷冻移植研究并探讨线粒体功能状态，进一步研究白藜芦醇在人类卵巢冻存和移植中的作用机制。

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（收稿日期：2019-06-19） （本文编辑：程旭然）